第二节 DNA片段的扩增――PCR技术
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第二节 DNA片段的扩增――PCR技术
[课标要求]1．理解PCR的原理，讨论PCR应用。 2．尝试PCR技术的基本操作。 [知识梳理]一．背景知识1． 细胞内DNA复制步骤：（1）在 作用下解开DNA双链(2 ) 在 作用下，以DNA单链为模板，合成一段 ;（两条DNA模板链各需一个RNA引物）(3 ) 以RNA引物为起点，在 作用下，以 为原料，按照碱基互补配对原则合成两条新链。2． 聚合酶链式反应(PCR)概念; 。3． PCR过程与细胞内DNA复制过程区别：（1）引物是人工合成的 单链，２０－３０个脱氧核苷酸，而不是RNA。(2) 解旋通过对反应 的控制来实现而不依靠 。4．PCR过程：(1) 将PCR缓冲液、 、一对引物、四种 、DNA聚合酶、Mg2+等成分加入到特制的微量离心管中。(2) 高温变性： 。(3) 低温复性： 。(4) 中温延伸： 。二． 实践案例 1．PCR实验虽然原理复杂，但操作十分简单，因为生物制剂公司已把PCR缓冲液、DNA聚合酶、脱氧核苷酸贮备液等组分配成了PCR试剂盒，实验人员仅需加入模板DNA及引物即可，所以快速、高效、灵活和易于操作是PCR技术的突出优点。 2．材料用具 略 3．活动程序 (1) 加入各种试剂，混合，离心10s，放入PCR仪中。(2) 扩增循环，在PCR仪上设置好PCR热循环程序：循环数高温变性低温复性中温延伸第一次95℃,5min55℃,1min72℃,1min30次95℃,30s55℃,30s72℃,1min最后一次 ――――72℃,7min注：反应产物在4℃保存 4．检测扩增效果 （1）稀释样品10倍 （2）以H2O作对照，在波长260nm处，将紫外分光光度计读数调到零。 （3）加入到厚度为1cm的比色杯中，测定260nm处的光吸收值 （4）DNA浓度（μg/mL）=（A260nm/0.02）×稀释倍数 三．探究活动 PCR实验虽然操作简单，但实验设备及药品价格较高，可以利用自己准备的简易材料，设计并进行PCR技术的模拟实验操作。 四．PCR技术意义 PCR能 ，从而有效地解决了因为样品中DNA含量 而难以对样品进行分析研究的难题，大大提高了对DNA分子的分析和检测能力，被广泛应用于 、基因序列分析、遗传病诊断，古生物学研究以及形侦破案、亲子鉴定等。五．小知识：1．DNA的两条链是反向平行的，为了明确地表示DNA的方向，通常将DNA的羟基(-OH)末端称为5’端。DNA聚合酶不能从头开始合成DNA，而只能从3’端延伸DNA链。但DNA合成的方向是从子链的5’端向3’端延伸。2．引物是一段RNA，它能与DNA母链的一段碱基序列互补配对。用于PCR的引物长度通常为20―30个核苷酸。3．在80ºC―100ºC的温度范围内，DNA的双螺旋结构将解体，双链分开，这个过程称为变性。当温度缓慢降低后，两条彼此分离的DNA链又会重新结合成双链。[复习指导]本节课复习要注重细胞内DNA复制过程和体外DNA片段的扩增――PCR技术的过程，运用DNA复制过程原理相同的方法，明确体外DNA片段的扩增――PCR技术在基因克隆、基因序列分析、遗传病诊断，古生物学研究以及形侦破案、亲子鉴定等方面的地位和作用。如何在体外创设细胞内DNA复制的条件是PCR技术的关键，细胞内的各种条件实际上是利用PCR仪来模拟的。PCR仪原理复杂，操作简单。[典例解析]1.PCR过程与细胞内的DNA复制过程相比，主要有两点不同，它们是（ ）①PCR过程需要的引物是人工合成的DNA单链②PCR过程不需要DNA聚合酶③PCR过程中DNA的解旋不依靠解旋酶，而是通过对反应温度的控制来实现的 ④PCR过程中，DNA不需要解旋，直接以双链DNA为模板进行复制 A． ①②③④ B． ①② C．①③ D．②④[解析] PCR过程与细胞内的DNA复制过程相比，主要有两点不同。第一，PCR过程需要的引物不是RNA，而是人工合成的DNA单链，其长度通常为20－30个脱氧核苷酸。第二，PCR过程中，DNA解旋不依赖解旋酶，而是通过对反映温度的控制来实现的。[答案] C。2．在PCR扩增前，需要将下列哪些物质加入微量离心管中？（ ）①模板DNA ②模板RNA ③DNA解旋酶 ④耐高温的DNA聚合酶 ⑤引物 ⑥PCR缓冲液 ⑦ 脱氧核苷酸贮备液 ⑧ 核苷酸贮备液A．①④⑤⑥⑦ B．①③④⑤⑥⑧C．②③④⑤⑥⑦ D．①④⑥⑦⑧[解析] 进行PCR过程前，将PCR缓冲液、DNA模板、一对引物、四种脱氧核苷酸、DNA聚合、Mg2+等成分加入到一种特制的微量离心管中。[答案] A