积雪草酸抑制HSCT6细胞Ⅰ型胶原蛋白表达(一)

详细内容

【摘要】 目的：研究外源性TGF?β对肝星状细胞系（HSC?T6）的激活作用，以及积雪草酸抑制HSC?T6细胞Ⅰ型胶原蛋白合成的药理作用. 方法：用LDH和MTT实验测定积雪草酸对HSC?T6细胞的细胞毒性和细胞增殖的影响. 检测HSC?T6细胞受不同剂量和不同时间TGF?β刺激后表达Ⅰ型胶原蛋白的最佳剂量和时间. 以不同剂量的积雪草酸作用于TGF?β活化的HSC?T6细胞，提取细胞总蛋白，以Western Blot方法检测积雪草酸对TGF?β活化的HSC?T6细胞Ⅰ型胶原蛋白表达的影响. 结果：TGF?β刺激HSC?T6细胞表达Ⅰ型胶原蛋白的最佳剂量为1 ng/mL，最佳时间24 h. 10～30 μmol/L积雪草酸可以抑制TGF?β诱导的HSC细胞Ⅰ型胶原蛋白表达. 结论：外源性TGF?β可激活HSC?T6细胞表达Ⅰ型胶原蛋白；积雪草酸抑制HSC?T6细胞Ⅰ型胶原蛋白表达.

【关键词】 积雪草酸; Ⅰ型胶原蛋白; HSC?T6细胞; 转化生长因子?β

　　0引言

　　传统中药积雪草具有促进伤口愈合和抑制瘢痕增生药效〔1-2〕. 新近的研究表明积雪草能够抑制瘢痕组织来源的成纤维细胞的增殖和纤维蛋白的合成〔2〕. 肝星状细胞在肝纤维化过程中起着至关重要的作用. 本研究以积雪草酸作用于SV40病毒大T抗原转化的肝星状细胞（HSC?T6），研究积雪草酸对HSC?T6细胞胶原蛋白合成的影响.

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　积雪草酸（SIGMA， Cat: 546712）， 黄棕色粉末， 无臭， 味苦. 分子式为C48H78O5， 熔点325℃～330℃，不溶于水，溶于二甲亚砜(DMSO), 储存液浓度20 mmol/L. TGF? β1（R&D Systems， Cat 240?B），储存液浓度10 mg/mL. HSC?T6由纽约Mount Sinai医学院 Friedmen教授赠送，维持培养在低糖型DMEM（Invitrogen）培养基中，添加10 g/L青链霉素（Invitrogen）和100 mL/L胎牛血清（Hyclone）. 1×105细胞2.5 mL铺6孔培养板， 50 mL/L CO2, 37℃ 培养24 h，换含2 mL/L胎牛血清DMEM继续培养24 h. TGF?β剂量实验组分别加入0.1, 0.5, 1, 2, 5 ng/mL TGF?β，培养24 h后收取细胞蛋白；TGF?β时间实验中各组均同样加入1 ng/mL TGF?β，分别在0, 6, 1, 24, 48 h收取细胞蛋白；积雪草酸实验分别加积雪草酸 0, 5, 10, 20, 30 μmol/L，2 h后除空白对照孔外，各孔加1 ng/mL TGF?β，24 h后提取细胞蛋白.

　　1.2方法

　　1.2.1乳酸脱氢酶细胞毒性实验（LDH）

　　LDH试剂盒购自SIGMA公司. HSC?T6细胞维持培养在100 mL/L胎牛血清、10 g/L青链霉素的DMEM中. 1×105 HSC?T6铺96孔板，细胞连续性达70％，吸弃上清，无血清DMEM 200 μL 洗2次. 2 mL/L胎牛血清DMEM中加入积雪草酸或DMSO，浓度分别为2.5, 5, 10, 20, 30, 40, 60, 80 μmol/L，200 μL加入细胞培养孔， 20 g/L Triton?100作阳性对照，2 g/L胎牛血清DMEM作阴性对照，每剂量组各为3孔，37℃，50 mL/L CO2培养24 h. 将每孔上清吸出置另一96孔板相应孔，2000 r/min, 5 min待测. 将原各孔中残余液体吸干净，加入含20 g/L Triton?100的DMEM 200 μL, 37℃，50 mL/L CO2培养30 min，使细胞裂解，2000 r/min, 5 min. 按试剂盒操作说明检测上清中以及细胞内的LDH，以490 nm波长测定A值，LDH释放率=A上清/(A上清+A细胞内)×100%.

　　1.2.2细胞增殖活性实验（MTT）

　　HSC?T6细胞培养方法以及积雪草酸处理浓度和对照组的设置均与LDH检测方法中描述的相同. MTT检测试剂购自Promega公司. 加入MTT染液在37℃培养4 h, 加入溶解液室温过夜，测定A570 nm/A650 nm双波长的吸光度.

　　1.2.3蛋白质提取及定量用RIPA（10 g/L Nonidet P?40, 1 g/L SDS, 1 mmol/L PMSF, 5 g/L sodium deoxycholate, 1 mmol/L sodium orthovanadate, 10 mmol/L sodium fluoride in PBS）

　　细胞蛋白裂解液250 μL，将6孔板每孔中的细胞蛋白收集至1.5 mL离心管管中，超声粉碎500 W, 3 s×6次，以4℃, 10 000 r/min离心10 min，收取上清. 细胞蛋白浓度测定按照Bio?Rad Laboratories蛋白测定试剂盒（Cat500?0113）说明书来操作. 用RIPA裂解液将蛋白调节为一致浓度后，加入等体积的2×SDS上样缓冲液（100 mmol/L Tris・HCl, 40 g/L SDS，200 g/L甘油，2 g/L bromophenol blue）. 100℃蛋白变性5 min备用.

　　1.2.4免疫印记40 mL/L积层胶，100 mL/L分离胶，总蛋白20 μg的样本，加样至100 mL/L SDS?PAGE中电泳100 V，90 min. 然后将蛋白转移至PVDF膜，150 V，90 min. 转膜后TBST洗膜. 以50 mL/L脱脂奶粉?TBST封闭液室温下封闭60 min；TBST洗膜. 加入适当浓度的一抗孵育，4℃轻摇过夜. TBST洗膜：加入适当浓度的结合HRP的二抗（1∶10 000至1∶30 000）及HRP?anti?biotin二抗（1∶5000）孵育，室温下轻摇60 min. ECL或ECL plus显影1 min后，在暗室中进行曝光2 s~15 min.