人血清中小分子蛋白质分离电泳方法改进(一)

【关键词】 ,聚丙烯酰胺凝胶电泳；蛋白质；分离

　　摘要： 目的 建立一种灵敏易行分离分子量＜10 000 Da低丰度蛋白质的电泳方法。方法 用Hitrap Blue层析柱去除血清中白蛋白，用U9对血清样品进行变性处理，采用改进后的方法(01%甲醇，05%三氯乙酸，01%考马斯亮蓝G250)进行染色。结果 经去除血清中的白蛋白、对样品进行变性处理及改进染色方法后，分辨率和灵敏度明显提高，可有效分离10 000 Da以下的小分子蛋白质。结论 改进后的电泳方法，不仅简便灵敏，而且还有利于蛋白质的洗脱回收。

　　关键词： 聚丙烯酰胺凝胶电泳；蛋白质；分离

　　Separation of micro molecular protein in human serum with improved Tricine-SDS-PAGE system

　　Gangxi Center For Disease Control and Prevention(Nanning 530021,China)Abstract： Objective To separate less abundant proteins less than 10 000 Da with an effective Tricine-SDS-PAGE system.Methods The human serum albumin was removed by Hitrap Blue column,and serum was dealed with U9.Then gel was stained by the improved method(01% carbinol,05% TCA,01%Coomassie briliant blue G250).Results The discovery and detection of less abundant proteins less that 10 000 Da were improved obviously by removal of human serum albumin,serum treated with U9 and improvement of staining.Conclusion The improved Tricine-SDS-PAGE system is not only effective to resolve these less abundant proteins less than 10 000 Da,but also favourable to recover these proteins from gel.

　　Key words： SDS-PAGE;protein;separation

　　患者血清中某些小分子蛋白标志物可以用于疾病监测和快速诊断，但分离分子量＜10000Da的小分子蛋白质面临很多问题。三(羟甲基)甲基甘氨酸聚丙烯酰胺凝胶电泳(TricineSDSPAGE)是目前一种有效分离小分子蛋白、多肽的电泳方法，可以用于分离小至1kDa的小分子肽〔1〕。但其分离效果与样品处理、样品中目的蛋白含量以及染色方法等密切相关。文献报道，使用TricineSDSPAGE分离小分子蛋白的样品多为蛋白质标准品〔1-3〕。作者在分离小分子肽的实验中发现，根据文献报道的方法，对于分离蛋白标准品或高丰度蛋白效果尚可，但直接用于分离人血清中低丰度的小分子蛋白效果并不理想。因此，作者在样品的处理、染色等方面进行改进，建立了一种效果理想、简便灵敏的分离人血清中小分子蛋白质的方法。结果报告如下。

　　1 材料与方法

　　11 材料

　　111 试剂与仪器 磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、氯化钠、尿素、丙烯酰铵、N，N＇-甲叉双丙烯酰铵、过硫酸铵、盐酸、氢氧化钠、甘油、溴酚蓝、三氯乙酸(TCA)、甲醇、戊二醛、醋酸、考马斯亮蓝G250、低分子量蛋白质标准品、三羟甲基氨基甲烷(Tris)、三羟甲基甲基甘氨酸(Tricine)、二硫苏糖醇(DTT)、3-〔(3-胆酰胺丙基)-二乙胺〕-丙磺酸(CHAPS)、十二烷基硫酸钠(SDS)、四甲基乙二胺(TEMED)(上海生工生物工程有限责任公司)；AKTA Purifier-900层析系统、Hitrap Blue层析柱(美国Amersham Biosciences公司)；Power Pac HCTW电泳仪、Mini Protean 3well垂直电泳槽(美国Bio-Rad公司)；摇床(江苏海门市其林贝尔仪器制造有限公司)。

　　112 样品 样品取自广西医科大学第一附属医院经病理诊断的肝细胞癌患者血清。

　　12 方法

　　121 溶液配制 (1)层析缓冲液配制：结合缓冲液为390ml的20mmol NaH2PO4和610ml的20mmol Na2HPO4溶液混合成1000ml的磷酸盐缓冲液，用HCl调pH值至70。用配制好的结合缓冲液配500ml的2mol NaCl磷酸盐洗脱缓冲液。(2)凝胶贮存液配制：A贮液为495%丙烯酰铵总浓度，3%交联度的丙烯酰铵贮存液：称取48g丙烯酰铵和15g N，N＇-甲叉双丙烯酰铵，溶于100ml双蒸水，溶液混匀后经滤纸过滤。B贮液为495%丙烯酰铵总浓度，6%交联度的丙烯酰铵贮存液：称取465g丙烯酰铵和3g N，N＇-甲叉双丙烯酰铵溶于100ml双蒸水，溶液混匀后经滤纸过滤。胶缓冲液为3mol Tris，03g/L SDS用HCl调pH值至845。(3)蛋白质电泳溶液配制：阳极缓冲液为02 mol Tris,用HCl调pH值至89，阴极缓冲液为01mol Tris，01mol Tricine，03g/L SDS用HCl调pH值至825。(4)样品缓冲液配制：3mol Tris(pH 845)，24 ml甘油，08g SDS,03mol DTT，少许溴酚蓝，定容至10ml。

　　122 层析柱去除白蛋白 冻融血清，4℃，12000r/min，离心5min，取上清液1ml，用9ml结合缓冲液按1∶9比例稀释上样于Hitrap Blue层析注，在AKTA Purifier900层析系统上进行层析分离，用磷酸盐洗脱缓冲液以流速2ml/min进行洗脱。在层析过程中，AKTA Purifier900层析系统自动收集未与层析柱结合部分的溶液和洗脱液(1ml/管)，并绘出280nm波长处的吸光度(A280nm)曲线。

　　123 胶的制备 按文献〔2〕分别配制分离胶、间隙胶和浓缩胶，依次灌胶。

　　124 样品处理 将样品1(未与层析柱结合部分的溶液)和样品2(洗脱液)，分别倒入3000Da的超滤离心管，4℃，12000r/min，离心浓缩2h，浓缩体积至1ml。分别加入到含2ml U9缓冲液(9mol Urea,2%CHAPS,1%DTT)的离心管，400～600r/min冰浴振荡30min。取样品1、2分别与样品缓冲液等体积混匀，60℃水浴加热5min。

　　125 电泳条件 内槽装阴极缓冲液，外槽用阳极缓冲液恒压电泳，先40 V约15 h，当样品进入分离胶时，电压升至60V约15h。

　　126 染色和脱色 电泳结束时，用双蒸水把胶面洗净。分别采用方法1：置于新鲜配制的5%戊二醛溶液中固定，50～60r/min，振荡1h。然后用双蒸水洗净胶面，用含0025%考马斯亮蓝G250的10%醋酸溶液染色，50～60r/min，振荡1h，最后转至10%醋酸溶液脱色，直到背景清晰。方法2：置于染色液(01%甲醇，05%TCA，01%考马斯亮蓝G250)中，50～60r/min，振荡染色1h。然后用双蒸水洗净胶面，转至双蒸水脱色，1h。更换双蒸水2～３次，直到背景清晰。

　　2 结果

　　21 层析柱去除血清白蛋白前后的比较(图1，图2) 血清经Hitrap Blue层析柱分离后，得到2个吸收峰，分别命名为组分Ⅰ、组分Ⅱ。组分Ⅰ为未与层析柱结合的蛋白质，组分Ⅱ为白蛋白洗脱液。组分Ⅰ、Ⅱ与血清原样的电泳结果比较显示，血清原样白蛋白污染严重，组分Ⅰ经去除白蛋白后，白蛋白污染显著减少，电泳可分离出10000Da以下的小分子蛋白质。