人NDRG1的GST融合表达、纯化及相互作用蛋白检测(一)

【关键词】 谷胱甘肽琼脂糖

　GST fusion expression and purification of human NDRG1

　　【Abstract】 AIM: To better understand the function of NDRG1 and look for the interact protein through pulldown technic. METHODS: We digested the NDRG1 cDNA from the constructed vector NDRG1pPROEXHTb and transfered it into another vector pGEX4T1. After gene was sequenced, the rebinant vector NDRG1pGEX4T1 was transformed into E. coil DH5α and the strains highly expressing soluble GSTNDRG1 in LB medium containing ampicillin were obtained. The fusion protein was then purified by Glutathione Sepharose 4B and was incubated with HH. The interact protein with NDRG1 was observed by SDSPAGE. RESULTS: There was a new strip at Mr 4.0×104 when the purified protein and HH were incubated. CONCLUSION: The interact protein with NDRG1 is found in HH.

　　【Keywords】 NDRG1; GST; gene expression; glutathione sepharose 4B

　　【摘要】 目的： 为了更好的了解NDRG1的功能，通过pulldown技术寻找与NDRG1相互作用的蛋白. 方法： 从已构建好的NDRG1pPROEXHTb重组载体中酶切下NDRG1 cDNA，插入融合表达载体pGEX4T1，序列测定后，转化DH5α感受态细胞，在含氨苄青霉素的LB中高效表达. 表达的GSTNDRG1经过谷胱甘肽琼脂糖4B亲和层析纯化，并与高表达细胞系HH孵育，通过SDSPAGE检测和NDRG1相互作用的蛋白. 结果： 纯化蛋白和HH孵育后，在Mr 4.0×104处出现新增条带，应是与NDRG1相互作用的未知蛋白. 结论： 在肿瘤细胞HH中存在与NDRG1相互作用的蛋白.

　　【关键词】 NDRG1；GST；基因表达；谷胱甘肽琼脂糖4B

　　0引言

　　Ndrg家族（Nmyc downstreamregulated gene family） 是近几年发现的一系列和信号转导相关的分子. 它包括NDRG1NDRG4，其中NDRG4又分三个亚型： NDRG4B, NDRG4B(var)和NDRG4H. 而NDRG1是Kokame等1996年在研究高同型半胱氨酸血症引起动脉粥样硬化的机制时，在培养的人脐静脉内皮细胞中发现的一种由同型半胱氨酸诱导产生的产物，经证实为一个含有394个氨基酸，大小为Mr 47 000的蛋白，当时被命名为还原剂衣酶孝反应蛋白(RTP)，随后又有不同实验室也相继克隆到编码RTP的基因，并且赋予了它多个名字〔1〕. NDRG1在结肠癌细胞系中高表达，因而被视为是与细胞分化程度呈正相关的抑癌基因. 但新近报道，NDRG1不仅与肿瘤细胞的分化有关，也与动脉粥样硬化、血栓形成、组织缺氧有关，同时还参与应激反应，可被多种诱导剂诱导等〔2〕，所以检测NDRG1相互作用的蛋白会为其功能研究提供明确线索.

　　1材料和方法

　　1.1材料

　　质粒提取和胶回收试剂盒购自北京天为时代公司；低分子量蛋白(marker)购自上海生化试剂公司；BamHⅠ, EcoRⅠ, IPTG购自大连宝生生物公司；protease inhibitor cocktail购自Roche公司；质粒pGEX4T1, DH5α细胞株由第四军医大学生物化学与分子生物学教研室提供,NGDRG1pPROEXHTb由第四军医大学基础部生物化学与分子生物学教研室张景赠送；还原谷胱甘肽购自华美生物公司；谷胱甘肽琼脂糖珠购自CLONTECH公司；Western发光底物为pierce产品；其余试剂均为国产分析纯.

　　1.2方法

　　1.2.1表达载体的构建用BamHⅠ/EcoRⅠ将NDRG1从NGDRG1pPROEXHTb中切下，插入pGEX4T1表达载体，构建出重组表达载体（NDRG1pGEX4T1）.

　　1.2.2融合蛋白的表达将重组质粒转化E.coil DH5α感受态细胞，挑阳性克隆，在含氨苄青霉素的LB培养基中培养过夜，取5 mL菌液转接于500 mL含氨苄青霉素的LB中，37℃，3 h，待A600 nm值约达0.5左右时加入IPTG至终浓度为0.2 mmol/L，温度调至27℃，诱导表达3 h，然后于8000 g离心15 min，收取菌体，加入20 mL缓冲液（137 mmol/L NaCl, 2.7 mmol/L KCl, 10 mmol/L Na2HPO4, 2 mmol/L KH2PO4, 1 mmol/L PMSF, pH 7.4），吹悬并于-70℃冻存. 反复冻融3次菌体，然后超声裂菌（输出频率60 Hz，每次8 s, 10 min，冰上），离心（12 kg/min, 4℃, 10 min）, 分别取适量上清液和沉淀进行SDSPAGE电泳〔3〕，检验NDRG1pGEX4T1可溶性.

　　1.2.3融合蛋白的纯化取上清20 mL，加入1 mL谷胱甘肽琼脂糖珠(50%)，4℃，孵育30 mins,离心，沉淀用1 mL含1 mmol/L PMSF的1×PBS混悬，存于4℃，取适量进行SDSPAGE分析，并以NDRG1单抗为一抗，兔抗鼠为二抗进行Western验证.