青藤碱对佐剂性关节炎大鼠炎症免疫功能的影响(一)

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作者：陈方军 叶丽 胡伟 张荣宜 程远华

【摘要】 【目的】观察青藤碱（SINO）对佐剂性关节炎（AA）大鼠炎症免疫功能的影响。【方法】选用SD大鼠随机分为正常组，模型组，SINO低、中、高剂量组（剂量分别为60、120、240mg/kg），雷公藤多苷（TPT）组（剂量为30mg/kg）；除正常组外，其他组均采用弗氏完全佐剂足跖皮内注射复制AA模型；各组于造模后第12天开始给药，连续12d；观察不同时间段的大鼠足趾肿胀度及关节评分；采用放射免疫法检测滑膜细胞白细胞介素?1β（IL?1β）、肿瘤坏死因子?α（TNF?α）的含量；观察各组大鼠滑膜细胞的超微结构；采用逆转录-聚合酶链反应检测各组滑膜细胞IL?1β mRNA、TNF?αmRNA的表达。【结果】各剂量组SINO均可不同程度降低大鼠足趾肿胀度和关节炎评分，抑制滑膜细胞产生IL?1β、TNF?α，降低滑膜细胞IL?1β mRNA、TNF?αmRNA的表达（P＜0.05或P＜0.01），恢复AA大鼠滑膜细胞的形态。【结论】SINO治疗类风湿性关节炎的作用可能与其能抑制滑膜细胞分泌炎性介质，恢复滑膜细胞形态有关。

【关键词】 青藤碱/药理学； 关节炎，类风湿/中药疗法； 关节炎，类风湿/免疫学； 滑膜细胞/超微结构；

疾病模型，动物； 大鼠

类风湿性关节炎（rheumatoid arthritis，RA）是一种慢性全身性自身免疫性疾病，病理基础为关节滑膜炎，病因不明，临床表现复杂多样，严重危害了人类的身体健康。青藤碱（sinomenine，SINO）是从中药青风藤中提取的生物碱单体，具有抗炎、免疫抑制、镇痛、降压、抗心律失常等药理作用〔1-2〕。本研究以佐剂性关节炎（AA）大鼠为模型，观察SINO对AA大鼠滑膜细胞超微结构及分泌炎性细胞因子的影响，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 动物 SD大鼠,普通级,体质量180～200g，雄性，由安徽省医学研究所实验动物中心提供，合格证号：皖医动准01号。

1.2 药物及试剂 青藤碱（湖南正清制药厂生产，批号：0009101）；新生小牛血清（杭州四季青生物工程材料有限公司提供，批号：031020）；RPMI?1640粉（Sigma 公司提供）；雷公藤多苷片（TPT，上海复旦复华药业有限公司生产，批号：060503）；卡介苗（BCG，卫生部上海生物制品研究所产品，批号：20060101）；RPMI?1640培养液（Gibco 公司产品）；125I?IL?1β放免试剂盒购于北京北方生物研究所，其他试剂为分析纯。IL?1β引物大小377bp，上游：5＇?TTGTGGCTGTGGACAAGCTG?3＇，下游：5＇?GGTCTTTCATACACAGGG?3；TNF?α mRNA 引物大小249bp；上游：5＇?CTGGGCAGCGTTTATTCT?3，下游：5＇?TTGCTTCTTCTGTT?3；内参照β?actin引物大小147bp，上游：5＇?CACTGTGCTGCTCAGAGG?3＇，下游：5＇?ACACAGATGACTTGCGCTCAGG?3＇；以上引物均由上海生工公司合成。

1.3 仪器 JT12001型电子天平由上海精天电子仪器厂生产；YLS?TA足趾容积测量仪由山东省医学科学院设备站生产；水套式CO2培养箱为美国SHELLAB产品；GL20A全自动高速冷冻离心机由湖南仪器仪表总厂离心机厂生产；YJ?1450型医学净化工作台由苏州净化设备公司生产；倒置式显微镜为日本Olympus产品；J?1230型透射电镜为日本电子公司产品；GC?911型α放射免疫计数仪由中国科学技术大学中佳公司生产。

1.4 分组、给药及造模 SD 大鼠随机均分为6组：正常组，模型组，SINO 低、中、高剂量组（60、120、240mg/kg）和TPT组（30mg/kg），每组10只。按文献报道造模〔3〕，除正常组外，其他各组均以弗氏完全佐剂（卡介苗80℃、1h水浴灭活后与高压灭菌的液体石蜡充分碾磨混匀配成10mg/mL的乳剂）于每鼠左后足趾皮内注射0.1mL致炎。各给药组分别于致炎第12天开始灌胃给药，连续12d，正常组及模型组给予等容积的溶媒。

1.5 AA大鼠评价 参照文献〔3〕，采用足趾容积仪排水法测定右踝关节以下的容积（mL），分别于用药前、用药后第4、8、12、16天同法测量非致炎足的容积变化，以致炎前后差值表示其肿胀度（V肿胀）。多发性关节炎评分如下，0分：无肿胀；1分：1个趾关节受累；2分：多趾关节受累；3分：踝关节以下受累；4分：全爪受累。

1.6 滑膜细胞培养 致炎后第28天大鼠清醒状态下股动脉放血处死。无菌取双侧膝关节滑膜组织，滑膜细胞培养按文献〔4-5〕方法进行。以RPMI?1640重悬细胞1×109个/L，取500μL细胞悬液和10mg/L脂多糖（LPS）500μL置6孔板中，37℃、体积分数5%CO2培养箱孵育48h，收集上清液，-20℃储存，按125I放免试剂盒说明书方法进行白细胞介素?1β（IL?1β）、肿瘤坏死因子?α（TNF?α）含量测定。

1.7 透射电镜检查 收集滑膜细胞以体积分数4%戊二醛Milloning?s缓冲液预固定，磷酸盐缓冲液（PBS）洗涤，10g/L锇酸固定2h，梯度乙醇逐级脱水；环氧树脂包埋，超薄切片，醋酸双氧铀和枸橼酸铅染色，透射电镜观察摄像。

1.8 滑膜组织IL?1β mRNA、TNF?α mRNA的检测 滑膜组织IL?1β、TNF?α总RNA提取采用常规逆转录-聚合酶链反应（RT?PCR）〔4〕，用凝胶图像分析仪扫描，Lab Image 3.2凝胶图像分析软件求出目的条带灰度与内参照β?actin标准条带的比值（p）。

1.9 统计学方法 采用SPSS14.0软件进行方差分析。

2 结果

2.1 SINO对AA大鼠继发性炎症的影响 表1结果显示，SINO给药24d后开始发挥疗效，各剂量组SINO均可显著抑制AA大鼠的继发性足肿胀（P＜0.01），以SINO高剂量组作用最显著。