荆防散干预一氧化氮合酶?一氧化氮通路的抗炎机制实验研究(一)
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作者：刘晓帅 曾南 梁珂 赵璐 瞿礼萍 宋美芳 张崇燕
【摘要】 目的观察荆防散干预炎症模型动物一氧化氮合酶-一氧化氮（NOS/NO）通路的抗炎机制，为其功效和临床应用提供药理学依据。方法采用角叉菜胶诱导大鼠胸膜炎模型和卵白蛋白致小鼠哮喘模型，测定大鼠胸腔渗出液与小鼠肺组织匀浆中NOS，iNOS活力和NO含量的变化。结果荆防散各剂量组能不同程度地降低小鼠肺组织匀浆与大鼠胸腔渗出液中NOS、iNOS活力，并减少NO含量，其中以5 g・kg-1剂量作用显著。结论荆防散能通过抑制NOS活力，尤其是与炎症反应密切相关的iNOS活力，从而减少炎症介质NO的生成来发挥抗炎作用，提示干预NOS/NO通路是其抗炎作用机制之一。
【关键词】 荆防散； 抗炎； 一氧化氮合酶-一氧化氮通路
Abstract：ObjectiveTo investigate the mechanism related to NOS/NO pathway of anti-inflammatory action of JingFang San, and to pharmacological basis for its efficiency and clinical use of treating allergic inflammation disease.MethodsInflammated animal model were carried out by the carrageenan-induced pleurisy in rats and ovabumin-induced asthma in mice. Pleurorrhea in rats and lung tissue homogenate in mice were prepared for the detection of NOS activity and NO level.Resultspared with model group, JingFang San at the doses of 5，2.5 and 1.25 g・kg-1 could decrease the NOS activity and the NO level in inflammated area in different degree, and the suppressive effect was most significant at the dose 5g・kg-1 . ConclusionJingFang San has anti-inflammatory action in two animal inflammation models, which mechanism may be related to suppressing NOS activity, especially iNOS, and decrease the NO level.
Key words：JingFang San； Anti-inflammation； NOS/NO pathway
荆防散由荆芥和防风两味药材组成，具有发散风寒、祛风止痒之功效，应用于外感表证、过敏性鼻炎及过敏性皮炎等疾病的治疗。前期研究已证实荆防散具有良好的抗炎、抗过敏作用〔1〕。为进一步探讨其抗炎作用机制，本研究基于炎症性疾病发生时，一氧化氮（Nitric Oxide ，NO）生成的限速酶之一――诱导型一氧化氮合酶（Inducible Nitric Oxide Synthase ，iNOS）大量生成，而由iNOS产生的NO作为炎症介质广泛参与炎症、哮喘等疾病的病理发展过程的现代研究〔2〕，观察荆防散对炎症模型动物NOS/NO通路的影响来探讨其抗炎作用机制。
1 材料与仪器
1.1 药物荆防散提取液制备：按1∶1比例取适量荆芥与防风（荆芥Herba Schizonepetae，防风Radix Saposhnikoviae，均由我校卢先明教授鉴定符合药用标准），加10倍量水，参照2005年版《中国药典》Ⅰ部附录X“挥发油测定项”中甲法提取挥发油，挥发油另存，过滤药液，药渣按常规再煎煮2次，取滤液。合并3次滤液，浓缩，醇沉（乙醇含量60%），静置，过夜。过滤，回收乙醇。于浓缩液中加入挥发油，充分混匀，最终浓度为1 kg・L-1，4℃冷藏备用。参照2005年版《中国药典》Ⅰ部荆芥含量测定项，采用高效液相法测得荆防散中胡薄荷酮含量为64.74 mg・L-1。醋酸地塞米松片，天津太平洋制药有限公司产品，批号060201。
1.2 动物昆明种小鼠，体重20～25 g；SD大鼠，体重200～260 g，由四川省医学科学院实验动物研究所提供，合格证号分别为scxk（川）2004－15、scxk（川）2004-16。
1.3 试剂角叉菜胶，sigma, Lot 17H1148；一氧化氮测试盒（硝酸还原酶法，批号20070913）、NOS测试盒（测分型，批号20070913），南京建成生物工程研究所产品。
1.4 仪器Multiskan MK3酶标仪，Thermolab systems；BS323S电子天平，Sartorious；JY92-Ⅱ超声波细胞粉碎机，宁波新芝生物科技股份有限公司产品；980型超声雾化器，上海医械专机厂产品；SHIMAD20 SPD-10高效液相色谱仪。
2 方法
2.1 荆防散对卵白蛋白致哮喘模型小鼠的影响健康♂昆明种小鼠，按体重随机分为6组，分别为对照组、模型组及荆防散大、中、小（5，2.5，1.25 g・kg-1）剂量组及地塞米松组。除正常对照组腹腔注射生理盐水外，其余各组均于实验第1，7，15和21天分别iP卵白蛋白抗原液0.2 ml（含卵白蛋白100 μg、氢氧化铝1 mg）；实验第28天开始将小鼠置于钟罩内，以50 mg/L的卵白蛋白溶液（对照组用蒸馏水）雾化攻击，雾化速度可控且前后一致，1次/d，30 min/次，连续7 d。每次喷雾前30 min，正常对照组、哮喘模型组小鼠灌胃蒸馏水，其余各组分别灌胃给予相应药物。各组小鼠于末次攻击后24 h处死，取肺组织用生理盐水制成10%匀浆，-75℃保存备用。按照试剂盒说明测定肺组织中NOS，iNOS活力与NO含量。
2.2 荆防散对角叉菜胶致胸膜炎模型大鼠的影响健康♂SD大鼠，按体重随机分为6组，分组同实验“2.1”项。各组动物灌胃给药，1次/d，连续7 d。各组大鼠末次给药后30 min乙醚浅麻醉，于右胸腔注射1%角叉菜胶0.2 ml致炎（对照组注射等量生理盐水）。致炎后5 h，大鼠股动脉放血处死，打开胸腔，吸取胸腔渗出液，再用2 ml生理盐水冲洗胸腔，合并渗出液和冲洗液，3 000 r・min-1离心10 min，上清液-75 ℃保存备用。按试剂盒说明测定胸腔渗出液NOS，iNOS活力与NO含量。
3 结果
3.1 荆防散对卵白蛋白致哮喘模型小鼠的影响见表1。与对照组相比，模型组小鼠肺组织中的NOS，iNOS活力异常升高，同时NO含量显著增加，提示造模成功。与模型组比较，荆防散5，2.5，1.25 g・kg-1均能明显降低小鼠肺组织中NO含量（P＜0.05，P＜0.01），5，2.5 g・kg-1剂量明显抑制iNOS活力（P＜0.01，P＜0.05），且5 g・kg-1剂量对总NOS的活力亦显著抑制（P＜0.01）。