马齿苋合剂水提液抗单纯疱疹病毒2型的实验研究(一)
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作者：刘建国，喻国华，廖燕，曾怡春
【摘要】 目的观察马齿苋合剂水提液对单纯疱疹病毒2型(HSV-2)的抑制作用。方法马齿苋水提液作用于Hep-2、Vero细胞和原代兔肾(PRK)3种细胞上研究其抗病毒作用。结果马齿苋合剂水提液在Hep-2、Vero细胞和PRK细胞上均有明显的抗HSV-2作用，对HSV-2的最小有效浓度(MTC)为0.5 mg／ml，而且毒性低，最大无毒浓度(TDO)为12mg／ml，治疗指数(TI)为30.0，并有直接杀灭HSV-2的作用。结论马齿苋合剂水提液具有抗HSV-2作用。
【关键词】 马齿苋合剂水提液 单纯疱疹病毒2型
Abstract：ObjectiveTo study the inhibitive effect of Purslane misture water extract on HSV-2．MethodsThe anti-virus effect was observed on Hep-2，Vero and PRK cells after treated with Purslane misture water extract.ResultsThe water extract from Purslane misture possessed distinct anti-HSV-2 effect．The MTC was 0.5 mg／ml，TDO was 12 mg／ml，and TI was 30.0．It possessed low toxicity and direct killing-virus effect on HSV-2．ConclusionPurslane misture water extract possesses anti-HSV-2 effect．
Key words：Purslane misture water extract； Herpes simplex virus2(HSV-2); Experimental study
HSV-2是一种常见的传染性病原体，可引起生殖道疱疹、病毒性脑炎等多种疾病，而且是宫颈癌的协同诱因。马齿苋Portulaca'oleracea L．又名马齿草(《雷公炮炙论》)，马苋(《本草经集注》)，长命菜(《中国药用植物图鉴》),为马齿苋科植物马齿苋的全草，生于田野路边及庭院废墟等向阳处，分布于全国大部分地区。国内对马齿苋的研究〔1〕多集中于马齿苋的化学成分和抗菌作用的研究,但有关马齿苋合剂水提液的抗病毒实验研究很少。本文对马齿苋合剂水提液抗单纯疱疹病毒2型的药效进行了实验研究。现报道如下。
1 材料
1.1 细胞
Hep-2、非洲绿猴肾细胞（Vero细胞）和原代兔肾细胞（PRK）3种细胞引自江西省卫生防疫站，均用Eagle培养基传代培养。PRK取自10 d内的乳兔，常规方法制备细胞，用5％乳蛋白水解物培养。
1.2 病毒
HSV-2 333株由南昌大学医学院病毒研究所提供，Vero细胞于RPMI-1640基础培养液中加入10％的新生牛血清，100 U／ml青霉素，100 μg／ml链霉素，置5％CO2孵箱中37℃ 培养，3d传代1次。滴度为TCID50=105，实验用103 TCID50／ml。
1.3 药物
马齿苋(购于江西中医药高等专科学院附属医院中药房)40 g，配合黄芪60 g，放入500 ml三角烧瓶，加入双蒸水200 ml浸泡过液，经水连续提取3次，合并3次提取液共400 ml，56℃水浴浓缩至100 ml，抽滤除菌，分装小瓶放-20℃ 冰箱保存备用。无环鸟苷滴眼液(ACV) (湖北潜江制药股份有限公司生产，批号H19993456)，用Hank's稀释成不同浓度，放置冰箱保存备用。
2 方法
2.1 细胞毒性实验
将已长满单层的Hep-2细胞、Vero细胞和PRK去生长液，换成含2％小牛血清的MEM维持液，每瓶细胞分别加入不同浓度的马齿苋合剂水提液(0.5～12 mg／m1)0.1 ml，每一浓度的药物均重复4瓶，并设未加药物的细胞做正常对照。置37℃培养箱中培养l44 h，每天观察细胞的变化情况，并记录结果。
2.2 病毒感染性滴度的测定
将不同稀释度的HSV-2接种细胞，每管0.1 ml，每个稀释度4瓶，37℃吸附1 h，弃上清液，加2％小牛血清的MEM培养液1 ml，置37℃培养，每日检查病毒生长情况，观察特征性细胞病毒(CPE)，7 d后记录结果。CPE记录方法：“-”为无CPE；“±”为可疑；“+”为25％的细胞出现CPE；“++”为50％的细胞出现CPE；“+++”为75％的细胞出现CPE；“++++”为100％的细胞出现CPE。
2.3 药物体外对病毒增殖的抑制作用
将病毒接种于已长满单层的细胞瓶上，每瓶接种103TCID50／ml HSV-2病毒液0.1 ml，37℃ 吸附1 h，弃上清液后，Hank's液洗3次，每一瓶加入含不同浓度的药物0.1 ml，加维持液0.9 ml，每个浓度药物均重复4瓶，并设置未加药物的病毒对照和细胞对照。然后置37℃培养箱中培养。每日观察CPE，当病毒对照达到“++++”时，判定结果，使病变减少两个“+”为有效。