结肠癌中RUNX3基因表达和启动子甲基化及其临床意义(一)
详细内容
【摘要】 目的 探讨RUNX3基因表达和启动子甲基化在结肠癌发生发展过程中的作用及其临床意义。方法 采用RT-PCR方法检测RUNX3基因表达，用甲基化特异性PCR(MSP)方法检测RUNX3基因启动子甲基化。结果 47例结肠癌中，癌旁肠粘膜、原发灶、肝转移灶中RUNX3表达阳性率分别为100%(47/47)、38.3%(18/47)、14.3%(1/7)。原发灶和肝转移灶中RUNX3表达明显降低(P0.01)。癌旁肠粘膜组织、癌原发灶、肝转移灶组织中RUNX3基因启动子甲基化阳性率分别为10.6%(5/47)，44.7%(21/47)，57.1%(4/7)，3种组织RUNX3基因启动子甲基化率的差别有显著性意义(P0.01)。在7例出现肝转移者中发生RUNX3失活者6例，其中4例(66.7%) 存在RUNX3基因启动子甲基化。结论 RUNX3基因启动子甲基化和RUNX3蛋白表达在结肠癌的癌旁组织和原发癌灶间存在显著的差异，可能与结肠癌的发生发展有关。
【关键词】 结肠癌;RUNX3;DNA甲基化
Abstract：Objective To study the function and clinic significance of expression and methylation of RUNX3 gene in promoter region in the genesis and progress of colon cancer.Methods Methylation specific PCR was used to detect methylation of RUNX3 promoter region. Expression of RUNX3 was examined by RT-PCR. Results In 47 cases of colon cancer, RUNX3 expression was detected at 100% (47/47)，38.3% (18/47)，14.3% (1/7) in paratumoral mucous membrane, primary cancer foci and hepatic metastasis respectively. RUNX3 expression in primary foci and hepatic metastasis was lower than that in paratumoral mucous membrane (P0.01). Methylation of RUNX3 promoter in paratumour mucous membrane, primary foci and hepatic metastasis was found at 10.6% (5/47)，44.7% (21/47)，57.1% (4/7) (P0.01). In 7 cases of hepatic metastasis, 4 (57.1%) were found with RUNX3 promoter methylation. Conclusions Methylation of RUNX3 promoter leads to inhibition of RUNX3 gene in colon cancer.
Key words：colon cancer; RUNX3; DNA Methylation
RUNX3基因是近年来发现的抑癌基因，动物实验表明，RUNX3基因的缺失可引起胃肠粘膜上皮细胞的异常增殖。在人胃癌细胞中，RUNX3基因的表达显著下降，而且其失活的主要机制是启动子甲基化和基因丢失[1]。RUNX3基因是否在结肠癌的发病中起重要作用，目前尚不完全清楚。本研究中我们检测了结肠癌中RUNX3基因表达和启动子甲基化状态，探讨RUNX3基因启动子甲基化与RUNX3抑癌基因失活的关系及其对结肠癌发生发展的影响和意义。
1 材料与方法
1.1 标本
本研究共47例结肠癌患者，男26例，女21例，年龄31～78岁。47例中出现肝转移者7例，均经影像学、手术和病理学证实。
1.2 DNA和RNA的制备
取手术切除结肠癌原发灶、癌旁肠粘膜、肝转移灶标本。标本保存于-80 ℃深低温冰箱。采用酚-氯仿法抽提基因组DNA，Trizol法提取总RNA。
1.3 RUNX3基因表达的检测
RT-PCR方法检测RUNX3基因mRNA的表达。RUNX3上游引物：5＇-GATGGCAGGCAATGACGA-3＇，下游引物：5＇-TGCTGAAGTGGCTTGTGGT-3＇，扩增片段长度：353bp。GAPDH上游引物：5＇-AACGGATTTGGTCGTATTG-3＇，下游引物：5＇-GGAAGATGGTGATGGGATT-3＇，扩增长度：208 bp。
1.4 DNA的亚硫酸氢钠修饰
在50 μL体积中加入DNA 1 μg，NaOH(终浓度0.2 M)，于37 ℃变性10 min，加新鲜配置的对二苯酚(10 mM)30 mL和亚硫酸氢钠(3 M)52 μL，50 ℃，16 h。用Wizard DNA纯化树脂纯化DNA，-20 ℃保存。
1.5 MSP分析RUNX3基因甲基化状态
采用MSP(methylation，specific PCR，MSP) 法对结肠癌RUNX3基因甲基化状态进行了检测。RUNX3甲基特异性引物，上游引物5＇-CGTCGGGTTAGCGAGGTTTC-3＇，下游引物5＇-GGCTAGCGAAAAACGA-3＇。RUNX3未甲基化引物，上游引物5＇-GTGGGTGGTTGTTGGGTTAGT-3＇，下游引物5＇-TTCAAAACTAACA-3＇。PCR反应总体积25 μL，其中含有经亚硫酸氢钠修饰后的DNA 3 μL，10×Ex Tag Buffer 2.5 μL，引物各1 μL，dNTP 2 μL，TaKaRa Ex Taq 0.5 μL。PCR 反应条件为首次95 ℃变性3 min，然后95 ℃变性30 s，63 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，最后72 ℃延伸5 min，共40个循环。取PCR产物5 μL，在2 %琼脂糖凝胶中电泳，紫外灯下照相。高云升：结肠癌中RUNX3基因表达和启动子甲基化及其临床意义辽宁医学院学报 2008年8月，29(4)
1.6 统计学分析
利用SPSS11.0软件对RUNX3 基因的启动子甲基化状况与临床病理资料之间进行统计学分析，采用χ2 (卡方) 检验分析不同组别RUNX3基因表达和RUNX3基因启动子甲基化的差别，当P0.05时被认为有显著性差异。
2 结 果
2.1 RUNX3基因启动子甲基化在结肠癌的发生率
47例结肠癌患者中，在癌旁肠粘膜组织、癌原发灶、肝转移灶组织中RUNX3基因启动子甲基化阳性率分别为10.6%(5/47)，44.7%(21/47)，57.1%(4/7)。癌旁肠粘膜、原发灶、肝转移灶组织中RUNX3基因启动子甲基化率的差别有显著性意义(χ2=47.52，P0.01)。存在肝转移的患者中RUNX3启动子甲基化发生率最高。
2.2 RUNX3基因甲基化与临床病理的关系
本研究未发现RUNX3甲基化与浸润深度、淋巴结转移、组织分化程度等临床病理参数有显著的相关性。
2.3 RUNX3基因启动子甲基化与结肠癌RUNX3基因失活的关系
在47例结肠癌中，癌旁肠粘膜、原发癌灶、肝转移灶组织中RUNX3表达阳性率分别为100%(47/47)、38.3%(18/47)、14.3%(1/7)，原发癌灶和肝转移灶中RUNX3表达明显降低(χ2=23.4，P0.01)。在RUNX3失活的29例原发癌灶组织中，21例(72.4%)出现RUNX3基因启动子甲基化。在7例肝转移灶中发生RUNX3失活者6例，其中4例(66.7%) 存在RUNX3基因启动子甲基化。原发癌灶和肝转移灶之间RUNX3启动子甲基化在RUNX3基因失活所占比例的差异无显著性意义(χ2=0.57，P>0.05)。