针刺诱导脑缺血耐受的研究(一)

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作者：王晶余 陈维 袁佐鸣 张春玲

【摘要】 目的 探讨针刺诱导缺血耐受的内源性脑保护机制。方法 应用线栓法制做大鼠局灶脑缺血模型，选用百会穴进行针刺预处理。通过神经学评分、脑梗死体积测定、病理学及微小管相关蛋白2（MAP2)免疫组化染色对缺血耐受模型进行评价。结果 针刺预处理1、3、5 d均可对后续的大脑中动脉闭塞（MCAO）产生保护作用，神经病学评分降低，脑梗死体积缩小，病理损伤减轻，以5d最为明显。结论 成功复制针刺?局灶性脑缺血耐受模型，针刺可诱导脑缺血耐受。

【关键词】 针刺；预处理；脑缺血耐受

临床和实验研究表明，针刺可增加脑血流量，改善脑组织氧合，提高超氧化物歧化酶活性，抑制兴奋性氨基酸，诱导保护性基因表达，调节神经内分泌，对缺血性脑损伤有显著的治疗作用和保护效应〔1〕。有研究表明针刺能够产生有效缺血耐受，对缺血性脑卒中有保护作用〔2〕，但针刺产生缺血耐受的机制尚不完全清楚，对其相关研究甚少。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物与分组 健康雄性Wistar大鼠，体重250～300 g，由吉林大学实验动物中心提供。模型评价30只，随机分为正常对照组、单纯缺血24 h组及针刺1、3、5 d预处理后大脑中动脉闭塞(MCAO)24 h组，每组 6只。
　　
　　1.2 针刺预处理方法 应用DM?A定量针麻仪，参照《实验针灸学》给予Wistar大鼠顶骨正中百会穴电针刺激，采用频率为4～16 Hz的间断疏密波，电流强度1 mA，每次30 min，1次/d。

　　1.3 动物模型制备 采用Longa线栓法：大鼠用10%水合氯醛（0.32 ml/100 g）腹腔注射麻醉后仰卧于手术台上，颈部正中切口，暴露颈总动脉，逐步分离出颈外动脉、颈内动脉及分叉部，结扎颈外动脉远端，用动脉夹夹闭颈总动脉，在颈内动脉下方穿一提拉线以阻断血流，在结扎线近端距分叉5 mm处剪一约0.2 mm小口，将鱼线前端用砂纸磨成圆形并用肝素涂布后从颈外动脉残端插入，经颈总动脉分叉部进入颈内动脉，向上深入至分叉以上。平均进线（22±0.1）mm，直至感觉有阻力时，即阻断大脑中动脉入口处，结扎颈外动脉近端完成MCAO。正常对照组仅暴露颈总动脉分叉处，不插线阻断大脑中动脉。

　　1.4 神经病学评分 麻醉苏醒后，将动物放回鼠笼，自由饮食，分别于MCAO后24 h，由不了解分组情况的观察者评估并记录神经行为评分，参照Bederson评分标准〔3〕，0级：未见行为缺陷；1级：前肢屈曲 （即提尾悬空试验阳性）；2级：侧推抵抗力下降 （即侧向推力试验阳性），伴前肢屈曲，无转圈行为；3级：同 2级行为，伴自发性旋转。

　　1.5 梗死体积判定 经灌注固定大鼠整个脑组织后，从后至前进行石蜡冠状切片，片厚4 μm，每隔2 mm切取一张行HE染色，根据Reempts 介绍的公式〔4〕，拍照并用图像分析软件计算出脑片上梗塞灶体积与大脑半球体积的百分比。

　　1.6 病理标本制备 大鼠以10%水合氯醛麻醉，暴露心脏，以12号穿刺针刺入左心室，眼科剪刀剪开右心房，首先灌注温0.9%生理盐水约200 ml，待从右心房流出液体清亮时，换用含4%多聚甲醛的0.1 mol/L PBS（pH7.4）缓冲液200 ml进行灌注固定，断头取脑。取以视交叉为中心，相当于前联合连续脑片，继续固定4～6 h，常规脱水，透明，浸蜡，包埋。

　　1.7 微小管相关蛋白2(MAP2)检测方法 采用免疫组化法。一抗来源为美国SANTANCREN试剂公司，染色采用SP法。

　　1.8 统计学处理 结果以x±s表示，均数的显著性采用t检验，所有统计学处理应用SPSS12.0统计软件。

　　2 结果

　　2.1 神经功能评分 正常对照组神经病学评分为0，针刺本身不引起神经功能缺损，针刺1、3、5 d预处理后MCAO 24 h神经功能评分为2.16±0.73、1.97±0.85、1.66±0.84，与单纯MCAO 24 h组(2.51±1.32)相比差异显著，针刺5 d最为明显（P＜0.01）。

　　2.2 梗死体积测定 单纯MCAO 24 h脑梗死体积比为（30.16±2.65）%，针刺1、3、5 d MCAO 24 h脑梗死体积比分别为（28.28±2.59）%、（25.24±2.52）%、（23.18±2.12）%，其中针刺5 d MCAO 24 h组梗死灶体积减少了23.2%，较单纯MCAO 24 h组明显降低（P＜0.05)。

　　2.3 病理形态学变化 正常对照组：神经细胞的形态分布正常。单纯MCAO组：缺血24 h，中心区淡染，脑组织稀疏明显，神经元脱失严重，细胞周围大空泡变，神经细胞变形，核固缩，核碎裂，核溶解，并失去完整结构，并有大量细胞残骸，周边区范围明显缩小，可见胶质细胞浸润。针刺预处理1、3、5 d MCAO缺血周边区范围缩小，其中形态完整的神经细胞增多，充血及脑水肿程度较单纯MCAO组轻，以针刺预处理5 d最为明显。

　　2.4 MAP2表达 免疫组化结果显示：正常对照组可见脑组织中神经元及树突均呈阳性表达，以树突表达更为明显，染色均匀，突起排列完整呈束状。缺血24 h，梗死中心区可见明显MAP2表达淡染区，无完整树突，树突排列不齐，散在断裂状，周边区表达明显，与中心区分界清楚，可见正常神经元与缺血改变神经元以及形态排列正常树突与增粗、部分断裂树突交替存在。1、3、5 d 针刺预处理中心区与MCAO表现一致，但针刺预处理使梗死范围明显缩小，MAP2正常表达神经元增多，缺血改变神经元减少，也可见形态排列正常树突与增粗、部分断裂树突交替存在，梗死范围以5 d针刺预处理最小。