钙整合素结合蛋白CIB的原核表达及多克隆抗体的制备与亚细胞定位(一)
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作者：石洁, 惠玲*, 张煦, 王晓辉, 杨金升, 吕同德, 赵治华, 哈小琴
【摘要】 目的: 构建钙整合素结合蛋白( calcium?and integrin?binding protein, CIB)的原核表达载体, 制备小鼠抗人CIB的多克隆抗体并探讨其亚细胞定位。方法: 采用RT?PCR方法从人脑组织扩增CIB的cDNA片段, 利用DNA重组技术构建原核表达载体pET32a?CIB, 转入BL21(DE3)中, 以IPTG诱导BL21(DE3)表达CIB融合蛋白, SDS?PAGE鉴定融合蛋白CIB的表达。用含CIB融合蛋白的聚丙烯酰胺凝胶颗粒为抗原免疫小鼠制备抗血清, 抗血清分别经Protein G、 抗原亲和层析后用Western blot及免疫组化方法进行鉴定。结果: 通过重组表达获得CIB抗原蛋白, 免疫小鼠并纯化抗血清得到特异性的抗CIB抗体, 该抗体能检测细胞内源性CIB蛋白的表达; 同时免疫组化结果显示: CIB在SHG44、 Hhu7细胞株中主要定位于细胞质。结论: 成功克隆CIB基因并制备了特异性的小鼠抗人的CIB多克隆抗体, 对进一步研究CIB的功能奠定了基础。
【关键词】 CIB; 基因重组; 融合表达; 多克隆抗体; 亚细胞定位
〔Abstract〕 AIM: To construct the prokaryotic expression vector pET32a?CIB, prepare the specific polyclonal antibody against CIB and study the subcellular localization of CIB. METHODS: CIB was amplified by RT?PCR from human brain tissue and cloned into prokaryotic expression vector pET32a?CIB. The CIB fusion protein was expressed in BL21 (DE3)/pET system and identified by SDS?PAGE. The mice were immunized with the polyacrylamide gel particles containing the CIB fusion protein for polyclonal antibody preparation. The antibody was purified by affinity chromatographic column matrix coupled with protein G, antigen respectively and then identified by Western blot and immunohistochemistry. RESULTS: The protein of CIB was obtained by rebination expression. The specificity of polyclonal antibody was obtained by immunizing BALB/c mice with polyacrylamide gel particles containing the fusion protein of CIB and purification. The results of immunohistochemistry demonstrated that CIB was localized predominantly in the cytoplasm of SHG44 and Hhu7 cells. CONCLUSION: The protein of CIB has been cloned and expressed suessfully. The specific polyclonal antibody against the protein of CIB has been obtained, which can be used for further research into the function of CIB.
〔Keywords〕CIB; gene rebination; fusion expression; polyclonal antibody; subcellular localization
钙整合素结合蛋白( calcium?and integrin?binding protein, CIB) 是1998年研究人员用integrin aIIb subunit为诱饵通过酵母双杂交得到的一个新基因, 对该蛋白的序列结构分析表明, 它含有4个EF?hand结构域, 其中EF?hand3、 4位于C端, 与钙离子有很高的亲和性〔1〕。它的许多特性与另一含有EF?hand结构域的恢复蛋白家族的神经钙感受器蛋白(NSC)相似〔2〕。与NSC蛋白不同的是CIB不只在神经元表达, 它在机体的许多组织如脑、 心脏、 肺等均有表达。CIB也是3个重要的钙结合蛋白之一, 与其他2个已知的参与多种蛋白调节的钙结合蛋白钙调磷酸酶B(calcineurinB, B)及钙调素(calmodulin, CaM)有很高的同源性, 研究表明CIB也与这个两钙调蛋白一样, 是一种钙离子感受器, 它与钙离子结合后会引起CIB蛋白构象的改变, 使它能与其他的蛋白因子结合, 从而影响细胞的功能。表达并制备其抗体对于基因的功能研究将起重要作用, 如免疫组化、 蛋白质相互作用的鉴定等许多方面工作的开展都需要有特异的抗体作为辅助。因此, 我们构建了CIB的原核表达载体, 进行了原核表达和纯化, 并免疫小鼠获得抗体, 为进一步研究CIB的功能提供参考。
1 材料和方法
1.1 材料 限制性内切酶、 T4 DNA连接酶、 各种工具酶均购自TaKaRa公司, Taq PlusI DNA聚合酶、 dNTPs、 引物购自上海生工生物公司, DMEM培养基购自Gibco公司, 胎牛血清为杭州四季青公司产品, 异丙基?β?D?硫代半乳糖苷(IPTG)、 弗氏佐剂均为Sigma公司产品, 辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗鼠IgG、 TITC标记的羊抗鼠IgG为北京中杉公司产品; 大肠杆菌BL21(DE3)和pET32 质粒（NOVAGEN）购自北京天为时代; BALB/c小鼠（雌性, 体质量18～22 g）由兰州军区兰州总医院医学实验动物科提供; SHG44胶质瘤细胞株、 Huh7肝癌细胞株由兰州军区兰州总医院医学实验中心惠玲博士提供。
1.2 方法
1.2.1 人脑组织总RNA的提取及逆转录 RNA的提取按Gibco公司的TRIzol试剂所提供的方法进行, 电泳检测RNA有无降解。在RNAse free的0.5 mL Eppendorf管内依次加入total RNA 2.0 μg; 500 mg/L oligo(dT)18 0.5 μg; Mili?Q(RNase free)水补足至11 μL; 振荡混匀, 置70℃水浴5 min。然后依次在离心管内加入: 5×reaction buffer 4 μL, 10 mmol/L 4dNTP 2.0 μL, ribonuclease inhibitor 20 U, 用Mili?Q(RNAse free)水补足至19 μL; 37℃水浴5 min; 加入200 U的Reverted M?MuLV reverse transcriptase, 混匀样品, 42℃水浴1 h。
1.2.2 引物设计及CIB的扩增 根据CIB基因的序列及pET32a的克隆位点, 选用EcoRⅠ、 SalⅠ作为克隆位点, 在CIB的两端设计分别含有EcoRⅠ、 SalⅠ酶切位点的引物, 5＇?CGGAATTCATGGGGGGCTCGGGCAGTCGT?3＇和5＇?TAG?CGGGCTCACAGGACAATCTTAAAGGAGCT?3＇, 以人脑cDNA文库为模板进行PCR, PCR扩增条件为: 94℃ 30 s, 56℃ 45 s, 72℃ 1 min, 36个循环, 最后72℃延伸5 min。
1.2.3 原核表达载体的构建 常规方法将CIB片段连接入原核表达载体pET32a中, 以载体测序引物进行测序。将测序结果和pET32a载体多克隆位点及CIB基因的ORF序列进行同源性比较, 验证融合质粒pET32a?CIB克隆正确。
1.2.4 重组质粒的诱导表达 将测序正确的CIB重组质粒转化BL21 (DE3) 细菌, 含有表达质粒的BL21(DE3) 单个菌落接种至5 mL LB培养液中, 37℃振荡过夜(置摇床中, 150 r/min)。按10 mL/L的量将过夜培养的菌液加入到5 mL的LB培养基中(含Amp 100 mg/L), 37℃振荡培养约2.5～3 h至A600≈0.4时, 加入终浓度为1.0 mmol/L的IPTG诱导, 37℃振荡培养。于诱导后4 h后离心, 收集菌体, 120 g/L的SDS?PAGE 电泳检测目的蛋白表达情况。
1.2.5 目的蛋白的凝胶电泳纯化 参照文献〔3〕, 细菌总蛋白经50 g/L积层胶, 150 g/L分离胶进行SDS?PAGE电泳, 倒积层胶时不要插梳子, 让积层胶的顶端和玻璃板的顶端之间有1 cm的距离（便于上样量较多）。电泳完毕后, 用预冷的0.25 mol/L的KCI溶液染色3～10 min。参照同样条件下用考马斯亮蓝R250染色的凝胶, 仔细辨认融合蛋白条带后, 用洁净的手术刀片切下融合蛋白所在的凝胶块, 用PBS洗2～3次后, 将凝胶快切成0.1～0.3 mm左右的小颗粒, 加入PBS, 反复冻融多次, 用PBS在4℃溶解过夜后离心, 上清中即含有较高纯度的目的蛋白。12 000 r/min离心, 取上清, 用120 g/L的SDS?PAGE对纯化效果进行鉴定。
1.2.6 多克隆抗体的制备和纯化 首次免疫时, 将含目的蛋白的凝胶颗粒与等体积的弗氏完全佐剂混匀, 多点注射于实验小鼠腹部皮下, 每点约20 μL, 每只小鼠约注入100 μg(约100 μg混合液)目的蛋白。分别于首次免疫后的第4、 6、 8周末进行加强免疫, 每次用约含100 μg目的蛋白的凝胶粒与弗氏不完全佐剂混合对实验小鼠进行腹腔注射。第1次免疫前采血并分离血清作为空白对照, 末次免疫后10 d采血分离血清, 免疫血清于-70℃保存。将制备的抗血清稀释5倍, 上样至Protein G亲和层析柱(按说明书操作)进行纯化, 用0.2 mol/L甘氨酸(pH2.7)洗脱, 收集的抗体溶液立即用1/10体积的1.5 mmol/L Tris?HCl(pH9.0)中和至中性。为得到特异的CIB抗体, 我们将大肠杆菌表达纯化的CIB蛋白偶联到溴化氰活化的Sepharose 4B上, 制备亲和层析柱, 将上述抗体溶液上样至此亲合层析柱上, 再使用pH2.7浓度为0.2 mol/L的甘氨酸洗脱液洗脱。分步收集洗脱液, 立即中和并透析, -70℃保存备用。
1.2.7 Western blot检测 常规方法培养SHG44胶质瘤细胞, 培养2 d后PBS洗涤细胞3次, 加入1×SDS细胞裂解液（62.5 mmol/L Tris?HCl (pH6.8 at 25℃), 20 g/L SDS, 100 g/L glyc?erol, 50 mmol/L DTT, 0.1 g/L bromophenol blue）100 μL, 收集裂解的细胞, 煮沸5 min, 离心后取上清10 μL进行SDS?PAGE电泳, 电泳结束后将蛋白用电转移方式转移到NC膜上, 转膜条件为电压100 V, 转膜时间90 min。滤膜经丽春红S染色后, 用标记笔标记蛋白相对分子质量（Mr）标准各个条带所在的位置, 再以TBST漂洗去除滤膜上的染料。将NC膜用100 g/L脱脂奶粉4℃常温封闭2 h后, 用制备的鼠抗人CIB多克隆抗体（1∶1 000）4℃孵育过夜, 用TBST每5 min洗1次, 共4次。然后加入HRP标记的羊抗鼠IgG二抗(1∶2 000), 4℃孵育4 h, 用TBST每5 min洗1次, 共4次。用DAB显色。
1.2.8 免疫荧光染色检测CIB的亚细胞定位 SHG44胶质瘤细胞、 Huh7细胞肝癌细胞传代后接种于内置盖玻片的6孔板中, 2 d后取出玻片。细胞爬片经40 g/L多聚甲醛固定4 h后, PBS洗涤3次, 3 g/L Triton破膜处理15 min, 加1∶100稀释的CIB多抗, 4℃过夜, PBS洗涤3次, 每次5 min, 加1∶100稀释的FITC标记的羊抗鼠IgG, 37℃ 30 min, PBS洗涤3次, 每次5 min。700 mL/L甘油封片, 荧光显微镜下观察。
2 结果
2.1 目的基因的扩增及载体构建 提取人脑组织的总RNA, 经RT?PCR扩增出约574 bp的目的片段, 与预期结果一致; 扩增片段与载体pET32a同时用EcoR I和Sal I双酶切, 回收后将目的片段连接到pET32a上, 得到重组质粒pET32a?CIB（图1）, 测序结果与pET32a载体多克隆位点和CIB序列进行同源比较后证明插入序列的读码框正确, 并有正确的方向, 表明质粒pET32a?CIB克隆正确。
图1 酶切鉴定 pET32?CIB重组质粒（略）
Fig 1 Restriction enzyme digestion analysis of pET?32a（+）?CIB
M: DL 2 000 DNA marker; 1: Rebinant plasmid pET32?CIB; 2: Digestion with EcoR I and Sal I; 3: Plasmid pET32; 4: PCR product of CIB gene.
2.2 CIB的原核表达及目的蛋白的纯化 将构建好的原核表达载体转入BL21(DE3)大肠杆菌中, 用IPTG进行诱导表达。120 g/L SDS?PAGE电泳结果可见与理论Mr 42×103大小相符的目的蛋白带, 将切下的含目的蛋白的凝胶块用PBS(pH7.2)4℃溶解过夜后, 离心收集上清, 用120 g/L SDS?PAGE对纯化效果进行鉴定。纯化后的CIB蛋白几乎不含杂蛋白, 纯化效果理想(图2)。
图2 CIB的原核表达及目的蛋白的纯化（略）
Fig 2 Analysis of CIB rebinants protein and Purification of CIB protein by 120 g/L SDS?PAGE
M: Protein marker; 1: CIB protein after purification; 2: pET32?CIB/BL21 induced by IPTG; 3: pET32?CIB/BL21 uninduced by IPTG; 4: pET32/BL21 induced by IPTG.
2.3 多克隆抗体的制备 SDS?PAGE电泳分析表明, 经过Protein G和CIB蛋白亲和柱两步纯化后, 可见清晰的抗体重链和轻链条带, 表明抗CIB多克隆抗体的纯化是成功的（图3）。
2.4 Western blot特异性检测结果 为了验证CIB抗体能否特异性的与内源性CIB蛋白结合, 本实验以SHG44的细胞裂解液为研究对象, 分别使用经Protein G和CIB蛋白亲和层析纯化后的多克隆抗体进行Western blot检测, 结果表明, 经Protein G纯化的抗血清可以检测到多条蛋白条带, 特异性较差, 经过CIB蛋白纯化的多抗能够与内源性的蛋白结合, 特异性增高, 仅在Mr 22 000左右处可见1条明显的蛋白条带, 证明抗CIB多克隆抗体具有较好的特异性（图4）。