人参水提物对β淀粉样蛋白诱导SH?SY5Y细胞凋亡的保护作用(一)
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作者：胡胜全 余惠? 刘塔斯 杨大坚 陈新滋 何翠君
【摘要】 目的研究人参水提物（water extracts of Ginseng, WEG）对β淀粉样蛋白（Aβ25?35）诱导SH?SY5Y细胞凋亡的保护作用。方法用Aβ25?35诱导体外培养的SH?SY5Y细胞凋亡，并用WEG进行保护。MTT法检测细胞存活率，Hoechst33258染色观察细胞形态的变化，流式细胞仪分析亚二倍体峰和DNA含量，检测细胞凋亡。结果Aβ25-35 50 μmol/L诱导SH?SY5Y细胞72 h后，镜下观察到细胞变圆，损伤并聚集，Hoechst33258染色可见明显的颗粒状和固缩状荧光，流式细胞仪检测到明显的亚二倍体峰，凋亡率达(37.30±0.69)%。而Aβ25-35和不同浓度的WEG(1，5，10，15 mg/ml)同时处理后，细胞形态明显改善，MTT值显著高于Aβ25-35处理组（P0.01），流式细胞仪检测凋亡率分别降低到(14.70±3.18)%，(7.23±1.51)%，(6.14±0.40)%，(5.88±1.33)%，呈现剂量依赖关系。结论人参水提物对Aβ25?35诱导的SH?SY5Y细胞凋亡有显著的保护作用。
【关键词】 SH?SY5Y细胞； Aβ25?35； 人参水提物； 细胞凋亡
Abstract：ObjectiveTo study the neuroprotective effects of water extract of Ginseng on SH?SY5Y cell apoptosis induced by Amyloid β peptide .MethodsSH-SY5Y cells were treated with Aβ25?35 to induce apoptosis in vitro, water extract of Ginseng was added into the culture to test its neuroprotective effects. The cell viability was measured by MTT test,the morphology of SH?SY5Y cells was observed by Hoechst33258 staining and DNA content by FCM. ResultsTreated by Aβ25-35 50μmol/L 72h later, SH?SY5Y cells turned rounder , aggregated and were positively stained with fluorochrome Hoechst 33258.Cells displayed a typical sub?diploid peak in flow cytometry ,and the percentage of apoptosis was (37.30±0.69)%（P0.01）. When incubated with Aβ25?35μmol/L and different concentrations(1，5，10，15 mg・ml-1) of WEG for 72 h, the characteristics of apoptosis as measured by FCM dose?dependently declined to (14.70±3.18)%,(7.23±1.51)%,(6.14±0.40)% and (5.88±1.33)% respectively (P0.05).ConclusionWater extract of Ginseng has marked neuroprotective effects on SH-SY5Y cell apoptosis induced by Aβ25?35.
Key words：SH-SY5Y cells； Amyloid β peptide； WEG； Apoptosis
阿尔茨海默症(Alzheimer's Disease，AD)，俗称老年痴呆症，为常见的中枢神经系统退行性疾病，是一种在正常意识状态下丧失智能能力的疾病。随着全球人口老龄化的程度加快，AD等神经退行性疾病在老年人中的发病率居高不下，给社会和家庭带来了沉重的负担。由于AD发病机制复杂，目前临床用于治疗AD的药物均只对发病过程中的某一或某几个环节起效，但副作用大。中药由于在防治AD等老年性疾病方面有丰富的实践经验及毒性相对小等潜在优势，越来越受到医学界的重视和推崇。本课题选择包含Rg1，Rb1等众多具有益智作用成分的人参，以中医药理论为指导，按照中药的传统煎煮法，制成水提物冻干粉，以Aβ25-35诱导SH-SY5Y细胞凋亡作为神经元损伤的体外模型，观察人参水提物对神经元的保护作用。
1 材料与方法
1.1 试剂Aβ25-35 (Sigma公司)；1640培养基(Gibico公司)；FBS(Hyclone公司)；Trypsin(Gibico公司)；MTT(Sigma公司)；DMSO(Sigma公司)；Hoechst33258(Fluka)；PI(Sigma公司)；RNase(sigma公司)；人参(深圳华辉药业有限公司，产地吉林，经湖南中医药大学药学院刘塔斯教授鉴定为人参)。
1.2 仪器CO2培养箱，美国Shellab；倒置荧光相差显微镜，德国Leica公司(型号：DC300)；超净工作台，ESCO公司；离心机，德国Hettich公司(型号：Rotofix32)；低温离心机，美国Coulter公司(型号：AllegraTM 21R)；流式细胞仪，美国Coulter公司(型号：Epics XL)；酶标仪，德国BMG公司(型号：Polar star Galaxy)。
1.3 药物制备
1.3.1 人参水提物取100 g人参粉碎，加8倍蒸馏水浸泡30 min，水浴2 h，纱布过滤，滤渣先后加6倍，4倍量水，各提30 min。3次滤液合并，冷冻干燥，得到40 g冻干粉，得率40%。冻干粉溶于灭菌去离子水，12 000 g，离心5 min，上清液过0.22 μm的滤膜，培养基稀释成实验所需浓度(以生药浓度计)。
1.3.2 Aβ25-351 mg Aβ25-35溶于943 μl灭菌去离子水，配制1 mmol/L的母液，-20℃保存，用前37℃老化7 d，培养基稀释成实验所需浓度。
1.4 细胞培养及预处理SH-SY5Y细胞取自本实验室细胞库。用含有体积分数为10%的FBS，1%的NEAA（非必需氨基酸）的1640完全培养基，于37℃，5%的CO2孵箱中培养。4 d进行1次传代，传代按1∶3进行。取生长期细胞进行实验。
1.5 实验分组将细胞分3组。正常对照组：常规加入完全培养基；Aβ25-35模型组：加入Aβ25-35；WEG保护组：同时加入Aβ25-35和不同浓度的WEG。
1.6 观察指标和方法
1.6.1 倒置显微镜观察细胞形态SH-SY5Y 以7×104 cells/ml密度接种于6孔板，模型组用终浓度为0，5，10，25，50 μmol/L 的Aβ25-35分别作用24，48，72 h，WEG保护组用0，1，5，10，15 mg/ml WEG 与Aβ25-35共同孵育（Aβ25-35作用浓度和时间点根据上述结果而设），每组均3个复孔，于倒置显微镜下观察并拍照。
1.6.2 MTT测定细胞存活率取对数生长期细胞，调整细胞密度为1×104 cells/ml，以100 μl/well接入96孔板，37℃，5%的CO2孵箱中培养36 h。36 h后吸弃旧培养基，正常对照组加入100 μl的新鲜培养基，Aβ25-35损伤组加入100 μl含有Aβ25-35的培养基，WEG保护组加入100 μl含有Aβ25-35和不同浓度的WEG的培养基，各浓度6个复孔。药物作用68 h后，每孔加5 mg/ml的MTT(PBS配)10 μl，4 h后，弃培养液，加DMSO150 μl/孔，轻轻振荡10 min，使甲湃颗粒溶解，用酶标仪在570 nm处读取吸光度(OD)值，取6孔均值按下列公式计算，细胞存活率（%）=实验组OD值/对照组OD值×100%。
1.6.3 Hoechst 33258染色形态学观察将SH-SY5Y细胞（7×104/ml）接种于6孔板内的盖玻片上，各实验组按要求给予不同的处理因素后，加入新鲜配制的4％多聚甲醛（pH为7.4）于37 ℃固定细胞30 min，PBS液洗两次，加5 mg/L Hochest 33258 染色液染色30 min，PBS液洗后，用封片液（20 mmol/L柠檬酸，50 mmol/L磷酸氢二钠，50％甘油，pH 5.5）封片后荧光显微镜观察、摄片。
1.6.4 PI单染流式细胞仪测定细胞凋亡率和细胞周期调整细胞密度为7×104 cells/ml，以1.5 ml/well种入6孔板。分组和处理同上。每组6个复孔。药物作用72 h后，细胞刮刮取细胞，1 000 r/min离心10 min，去上清，PBS漂洗两次，沉淀中缓慢依次加入70％的冰乙醇固定。-20℃固定24 h。固定后，1 000 r/min离心10 min，去上清，PBS漂洗两次，调整细胞浓度为1×106/ml。加RNase至终浓度100 μg/ml，37 ℃水浴30 min。加PI 至终浓度50 μg/ml，350目尼龙网滤膜过滤去除细胞团块，4 ℃避光染色30 min后，上流式细胞仪检测（激发波长：488 nm；发射波长：610 nm）各期细胞DNA的含量。每组3个复孔。测定数据按流式细胞仪所配置的软件进行数据处理，以DNA组方图出现低于G1期DNA含量的亚G1峰的大小代表凋亡细胞的多少。
1.6.5 统计学处理全部数据采用SPSS10.0统计软件进行统计分析，数据用±s表示，组间比较用单因素方差分析(One-way ANOVA)检验。