实验性脑出血后大鼠行为学和血肿周围组织病理学的研究

详细内容

1　材料与方法 1.1　材料和设备实验动物:健康SD大鼠40只,体重220~280 g,由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供 [许可证号:SYXK(鄂)2004-2007]。主要设备:大鼠脑立体定位仪(淮北正华生物仪器设备有限公 ·155·卒中与神经疾病2011年6月第18卷第3期司),微量进样器(上海佳安分析仪器厂),牙科钻(郑州市一美牙科工业有限公司),恒温冰冻切片机(沈阳市龙首电子仪器有限公司),显微镜(日本OLY- PUS公司)。

1.2　方法 1.2.1　根据Rosenberg等报道的胶原酶诱导ICH 模型法建立大鼠尾状核ICH模型。实验过程中对大鼠处置符合动物伦理学标准;6%水合氯醛腹腔麻醉大鼠(1ml/200g),俯卧位将大鼠固定在江湾大鼠脑立体定位仪上,先将门齿挂在门齿钩上,固定双耳间线,再将门齿固定在门齿钩上,使门齿钩平面较耳间线平面低2.4mm,使前囟和后囟位于同一平面上;头颅顶部常规消毒后在双耳间线与双眼间线之间取正中矢状切口1.5cm,切开至皮下;3%双氧水腐蚀颅骨外膜,暴露前囟及冠状缝;根据包新民图谱[6]定位右侧尾状核(前囟右旁开3.2mm,硬脑膜下5.6mm,向后1.4mm),在此处用牙科钻钻一直径约1.0mm的圆孔,深达硬脑膜表面;用微量注射器抽取Ⅶ型胶原酶液1.5μl(内含0.5UⅦ型胶原酶) ,将微量注射器固定于定位仪上,沿钻孔垂直进针至硬脑膜下5.6mm 处,将Ⅶ型胶原酶液缓慢推注入脑内,约5min,停针2 min,缓慢退出颅外;用骨蜡封闭颅骨钻孔,防液体沿针道外溢,最后缝合皮下组织及皮肤。假手术组除不注射VII型胶原酶外,其余条件完全一致。

假手术组和脑出血组大鼠清醒后按照Zea Longa(0~4分)法对大鼠神经功能进行评分,即0分:无神经系统损伤症状,活动正常;1分:提尾时不能完全伸展对侧前肢;2分:行走时身体向手术对侧转圈;3分:向手术对侧倾倒;4分:不能自发行走,意识丧失。1~3分视为模型制作成功。各组大鼠在1、3、7、14、28d五个时间点进行1次行为学评分。 组织形态学观察　各组大鼠经水合氯醛麻醉后,ICH后1、3、7、14、28d各时间点将大鼠断头取脑,oct胶包裹,于-80℃的异戊烷中速冻3~5 min,取出于-80℃冰箱保存备用;连续冰冻脑组织切片(10um),以针孔为中心行冠状位切片;切片行常规HE染色,冰冻切片用多聚甲醛固定10~30s, 流水洗1~2s,苏木精液染色30~60s,流水洗去苏木精液5~10s,1%盐酸乙醇1~3s,流水洗1~2 s,促蓝液返蓝5~10s,流水冲洗15~30s,0.5%伊红染色30~60s,蒸馏水稍洗1~2s,80%乙醇1~ 2s,95%乙醇1~2s,无水乙醇1~2s,石炭酸二甲苯2~3s,二甲苯(Ⅰ)2~3s,二甲苯(Ⅱ)2~3s, 中性树胶封固;在光镜下观察血肿及周围组织学变化。统计学处理　采用SPSS11.0软件包,组间采用t检验,P<0.05为有显著差异。

2　结　果 2.1　实验动物数量　本实验脑出血组共有6只大鼠被淘汰(其中4只于出血后48h死亡,考虑与严重脑水肿有关;2只无神经功能缺损症状,证实为血肿破入脑室而致),剔除上述情况后随机补充,最终分析仍为40只大鼠。神经行为学改变假手术组的所有大鼠麻醉清醒后均无明显神经功能缺损症状,神经行为学评分为0分,无明显差异。脑出血组大鼠3d时神经功能缺损症状最重,神经行为学评分最高;1d时神经行为学评分即非常明显,随着时间延长,7d时评分开始降低,14d时神经功能缺损已不明显。脑出血组的神经行为学评分显示3d与1d和7d无明显差异(P>0.05),而 3d与14、28d差异显著(P<0.05),且7d与14、28 d时间点无显著差异(P>0.05)。脑出血组的神经行为学评分显示3d时神经功能缺损症状最重,3d与1和7d无明显差异(P>0.05), 而3d与14、28d差异显著(P<0.05), 7d与14、28d时间点无显著差异(P>0.05) 2.3　脑组织显微结构观察假手术组:仅在针道周围见少量散在的血细胞, 以后可见少量增生的胶质细胞,其余部位无明显病理改变,见图2。脑出血组:脑出血1d时尾状核即形成明显的类圆形或不规则形血肿,血肿中心区有散在的神经细胞,周边区有水肿,可见中性粒细胞浸润;3d时病灶区血肿仍明显存在,脑组织明显水肿,可见细胞间隙增宽,神经元肿胀、胞核溶解甚至消失,见图3;7d时血肿血细胞溶解增多