尿激酶对大鼠胸膜成纤维细胞增殖与细胞凋亡的影响(一)
详细内容
作者： 邵景韫，刘安，戚好文，董玉
【关键词】 尿激酶；胸膜;成纤维细胞；细胞凋亡
Effect of urokinase on cell proliferation and apoptosis of rat pleural fibroblasts
【Abstract】 AIM： To study the effect of urokinase on the cell proliferation and apoptosis of rat pleural fibroblasts. METHODS: Rat pleural fibroblasts were primarily cultured to 4-12 passages， and then the medium was added with urokinase of different concentrations. After another 24-96 h culture， light microscope was used to observe morphological change. Apoptosis bodies were examined by fluorescent staining. Flow cytometry was used to detect apoptotic cells. RESULTS: Urokinase decreased the number of viable cells in time and concentration dependent manners. No apoptosis body or apoptotic cells were found by flow cytometry. CONCLUSION: Antiproliferative effect of urokinase on rat pleural fibroblasts is confirmed， but not related to cell apoptosis.
【Keywords】 urokinase；pleura; fibroblasts；apoptosis
【摘要】 目的：研究尿激酶（UK）对大鼠胸膜成纤维细胞（FB）增殖与细胞凋亡的影响. 方法：将大鼠胸膜FB原代培养，4～12代用于实验，FB与不同浓度UK共培养24～96 h；用光学显微镜观察其形态学改变；荧光染色查找凋亡小体；流式细胞技术观察有无凋亡细胞出现. 结果：UK以时间和浓度依赖的方式抑制细胞生长，但未发现凋亡小体，流式细胞技术没有检测到凋亡细胞. 结论：UK能够抑制FB增殖，其机制与细胞凋亡无关.
【关键词】 尿激酶；胸膜;成纤维细胞；细胞凋亡
胸膜纤维化是难治性胸膜炎的病理基础，胸膜成纤维细胞（fibroblasts, FB）增殖又是胸膜纤维化的主要原因. 目前，临床上应用尿激酶（urokinase, UK）防治炎性胸膜炎形成胸液包裹、胸膜黏连、肥厚等获得了明显效果，但机制不甚明确〔1-3〕. 因此，我们以研究大鼠胸膜FB为治疗靶位，观察UK对大鼠胸膜成纤维细胞增殖的抑制作用，探讨作用机制， 为UK防治炎性胸膜炎提供理论依据.
1材料和方法
1.1材料健康雄性SD大鼠1只,体质量160 g(第四军医大学实验动物中心)；胎牛血清(FBS,杭州四季青公司)；RPMI 1640培养液、胰蛋白酶(美国Gibco公司)；UK(辽宁天龙药业有限公司)；丫啶橙，MTT（华美生物工程公司）；小鼠抗大鼠波形蛋白mAb, 小鼠抗大鼠角形蛋白mAb, 小鼠抗大鼠第Ⅷ因子相关抗原mAb, 小鼠抗大鼠CD45抗原mAb(武汉博士德生物工程有限公司)；CO2恒温培养箱(德国Heraeus公司)；倒置显微镜(重庆光学仪器厂)；酶连免疫检测仪(国营华东电子管厂)；FACSCalibur流式细胞仪(美国BD公司)；荧光显微镜(日本Olympus公司).
1.2方法
1.2.1胸膜FB的分离、培养、纯化与鉴定用脊椎脱臼法处死SD雄性大鼠，无菌剥离胸膜，剪成1 mm×1 mm×1 mm左右的碎块，均匀铺满培养瓶底，加入含100 mL/L FBS的RPMI 1640培养液，于37℃,50 mL/L CO2条件下培养，2.5 g/L胰蛋白酶消化，按1∶2传代培养，自然纯化. 倒置显微镜下观察细胞学形态，对第4代细胞进行细胞鉴定，以卵蛋白生物素过氧化物酶复合法(ABC)法分别用抗细胞波形蛋白、抗细胞角形蛋白、抗第Ⅷ因子相关抗原和抗CD45抗原的小鼠抗大鼠mAb作免疫细胞化学染色鉴定胸膜FB.
1.2.2MTT法观察UK对大鼠胸膜FB增生的作用以2.5 g/L胰蛋白酶消化第4～6代大鼠胸膜FB,将单细胞悬液以5×107/L密度接种于96孔培养板,每孔200 μL，37℃，50 mL/L CO2条件下培养，2～3 d后细胞长满96孔培养板的1/2，再用无血清的RPMI 1640培养24 h，使细胞同步于G0期. 然后更换培养液，加入含有不同浓度UK的培养基（0，5×106，10×106，20×106，30×106 U/L），设12个复孔，分别培养24，48，72，96 h. 实验结束前4 h，每孔加入MTT溶液20 μL，继续培养4 h后，吸弃上清，每孔加入150 μL DMSO，振荡15 min，使结晶物充分溶解，在酶联免疫检测仪上测定各孔A490 nm值. 以时间为横轴，A值为纵轴，绘制细胞生长曲线.
1.2.3观察UK对大鼠胸膜FB凋亡的作用
1.2.3.1光镜形态学观察在6孔培养板中加入盖玻片，细胞长满后加入不同浓度的UK（5×106，10×106，20×106，30×106 U/L），不加药孔为对照组，24 h后收集盖玻片，PBS冲洗，纯丙酮固定8 min，用1 g/L的苏木精,0.1 g/L的伊红常规染色、脱水、透明、封片. 光镜下观察形态学改变.
1.2.3.2细胞荧光染色分别收集经不同浓度UK处理24 h的细胞，加入100 mg/L丫啶橙荧光染色液染色10 min，CaCl2分化，荧光显微镜下进行细胞凋亡的形态学观察.
1.2.3.3流式细胞仪结合PI及Annexin VFITC双标记染色测定细胞凋亡选对数生长晚期的细胞，分别加入5×103，10×103，20×103，30×103 U/mL UK，24 h后将5×105个细胞转移至离心管，用50 μL结合缓冲液重悬细胞，每组分别加入PI及Annexin VFITC，室温避光30 min上样，立即用流式细胞仪分析凋亡率.
统计学处理：数据以x±s表示，经SPSS软件分析，组间比较采用Oneway ANOVA检验.
2结果
2.1胸膜FB鉴定结果FB经8～10 ｄ培养后铺满瓶底，在倒置显微镜下见细胞呈梭形，胞核卵圆形，位于细胞中央，呈放射状或栅栏状排列（图1）. 成纤维细胞经免疫细胞化学染色后抗细胞波形蛋白抗原阳性（图2），抗细胞角蛋白阴性，抗第Ⅷ因子相关抗原阴性，抗CD45抗原阴性，证实培养细胞为大鼠胸膜FB.
2.2UK对大鼠胸膜FB增生的抑制作用UK作用后，所有加药组A490 nm值均低于对照组. 其中，5×106，10×106，20×106，30×106 U/L UK较对照组降低显著（P0.05），显示UK以时间和剂量依赖方式抑制细胞增殖（图3）.
2.3UK对大鼠胸膜FB凋亡作用的影响光镜形态学观察对照组大鼠胸膜FB大多数呈梭形，胞核卵圆形，位于细胞中央，呈放射状或栅栏状排列. UK作用24 h后，未发现凋亡细胞（图4）. 荧光显微镜形态学观察对照组大鼠胸膜FB大多数呈梭形，胞核卵圆形，位于细胞中央，呈放射状或栅栏状排列. UK作用大鼠胸膜FB 24 h后，细胞核完整，未见凋亡形态细胞（图5）. 凋亡细胞的流式细胞技术检测示UK作用大鼠胸膜FB 24 h后,无明显凋亡细胞出现（图6）.