活血化瘀方药对Poresky 大鼠模型内皮细胞的影响(一)
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【摘要】 ：〔目的〕观察活血化瘀方药对Poresky多囊卵巢综合征（PCOS）大鼠模型内皮细胞功能及形态的影响。〔方法〕依照Poretsky法建立PCOS大鼠模型，随机分为中药组、模型组，并设立正常组作对照。测定各组血清FSH、LH、T、INS及血浆ET、PAI?1的水平，电镜观察内皮细胞形态及超微结构变化。〔结果〕模型组内皮细胞间的连接失去正常形态，基底膜不连续，细胞膜损伤、不完整；胞质内空泡明显增多，线粒体膨胀，嵴溶解、断裂、消失；细胞核聚集，异染色质增多。中药组主动脉内皮细胞间连接较紧密，线粒体无明显肿胀，嵴清晰，吞饮泡和溶酶体增多，胞质偶见空泡。模型组血浆PAI?1、ET比正常组增高，差异有显著性（分别为P0.01，P0.05），中药组与模型组比较，ET、PAI?1降低（P0.05）；与正常组比较PAI?1水平无显著差异，ET增高（P0.05）。〔结论〕PCOS大鼠模型存在内皮细胞形态、超微结构改变，血浆ET、PAI?1升高，提示PCOS存在血瘀的微观病理基础。活血化瘀中药能够从形态学上修复PCOS大鼠损伤的内皮细胞，调整内皮细胞功能。
【关键词】 多囊卵巢综合征；动物模型；活血化瘀；内皮细胞
Abstract： 〔Objective〕To observe the effect of Chinese herbs for activating blood stasis on the shape and function of the endothelial cells in rat aorta.〔Method〕Rat models of PCOS have been established aording to Poresky, randomized into animal model and Chinese medicine group(TCM group)，normal rats were control group. Measure the serum level of FSH, LH, T, INS and plasma ET PAI?1, and observe the endothelial cell morph.〔Results〕 In the model group,the endothelia cells of the aorta were contracted, with discontinuous basement membrane, inflated chondriosome, the middle layer smooth muscles tending to move inside and out of the normal shape of intraendothelial junction. In the TCM group, the endothelial cells appeared flat, arranging along the long axis of the blood vessels, normal endothelial cell integrity with scanty cytoplasm and the microscopic appearance shows highly developed golgiosome rough endoplasmic reticulum and smooth endoplasmic reticulum.The model group had a more increased serum level of PAI?I and ET than those of the control group, and showed the significant difference (P0.01，P0.05). The TCM group had a significantly lower serum level of PAI?I and ET than those of the model group(P0.05). There were no significant differences between the normal group and the TCM group on serum level of PAI?I (P>0.05). The TCM group had more decreased level of ET than those of the normal group(P0.05). 〔Conclusion〕 The morphologic changes of the endothelial cells and increase of ET and PAI?I were found in the PCOS model rat，indicating blood stasis was one pathogenesis of PCOS.Chinese herbs for activating blood stasis could morphologically repair damaged endothelial cells, regulate their functions.
Key words: PCOS；animal model；activating blood stasis；endothelial cell
根据临床实践多囊卵巢综合征（polycystic ovarian syndrome，PCOS）患者即使无血瘀证的外在征象，临床上在辨证施治的同时，适当佐以活血化瘀之法，有助于提高疗效，从而提高排卵率。根据“以方测证”的原则，推测PCOS存在血瘀的微观病理改变。因此，本研究建立PCOS大鼠模型，观察内皮细胞（vascular endothelial cells cells，VEC）功能和形态变化及活血化瘀中药对其影响，寻求活血化瘀中药治疗多囊卵巢综合征的微观证据。
1 材料与方法
1.1 材料
SD雌性大鼠30只，SPF级，体重（200±20）g，由广州中医药大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK(粤)2003－0001粤监证字2005A031。胰岛素注射液(沈阳济世制药有限公司)、注射用人绒毛膜促性腺激素(HCG)(丽珠集团丽珠制药厂)、FSH、LH、E2、T检测试剂盒(罗氏诊断产品)、PAI?1检测试剂盒（上海西唐生物科技有限公司）、胰岛素检测试剂盒（河南省焦作市解放免疫诊断试剂研究所）、内皮素检测试剂盒（中国人民解放军总医院东亚免疫技术研究所）。活血化瘀方药（桃仁12g，红花10g，当归10g，熟地15g，川芎15g，赤芍15g，丹参15g），煎沸浓缩，制成2.5g/ml，4℃保存备用。中药饮片由广州中医药大学第一附属医院中药房提供。
1.2 方法
1.2.1 动物分组及处理
30只大鼠随机分为正常组对照、模型组、中药组，每组10只。每周称录体重1次，每天进行阴道涂片检查。2周后，模型组依照Poretsky法〔1〕每只动物皮下注射HCG1.5IU，2次/d，共9d；胰岛素注射液于第1～11d内自0.5IU/d开始，逐渐递增至6.0IU/ d，并按此剂量维持至22d，以5％葡萄糖溶液替代日常饮水中药组给予中药按25g/kg灌胃，每天9：00灌1次，连续21d。正常对照组每天注射等容积生理盐水并灌胃给予等体积常水。末次给药后禁食过夜，翌日动物称重，乙醚麻醉后取眼眶静脉血后，分离血清，置-20℃冰箱保存，待放射免疫测定FSH、LH、E2、T、ET、INS，酶免测定PAI?1。
1.2.2 卵巢组织观察
取其卵巢，去除卵巢表面的脂肪组织，10％甲醛液固定，酒精逐级脱水，透风，浸蜡包埋，5μm切片，HE染色，光镜观察。
1.2.3 内皮细胞观察
3.4％水合氯醛注入腹腔，将大鼠主动脉从主动脉根部至骼总动脉分叉处取出，剥离外层结缔组织，从腹侧而纵行剥开，生理盐水冲洗干净，2.5％戊二醇初固定后，4℃冰箱中保存备用。2.5％戊二醇PBS固定液4 0C固定2h，PBS缓冲液4℃洗涤2次；再以1％锇酸PBS固定液40C固定2h、PBS缓冲液漂洗2次；70％～100％梯度酒精、丙酮顺序脱水；Epon812包埋剂常规电镜包埋，LKBV型超薄切片机切片，醋酸双氧铀－柠檬酸铅双重染色各10min，制备透射电镜标本，采用透射电镜观察并拍照。
1.2.4 统计学分析
采用SPSS11.5统计软件，计量资料采用t检验，计数资料采用卡方检验。
2 结果
2.1 体重变化
处理前各组体重差异无显著性（P>0.05）。给药后，模型组实验后体重比正常对照组体重明显增加，差异有显著性（P0.05）；中药组低于模型组，但差异无显著性（P>0.05）。
2.2 阴道脱落细胞观察
处理前各组动物的阴道涂片均有明显的性周期变化。约第10天左右完成HCG给药后，模型组动物阴道脱落细胞持续角化，性周期变化基本消失，其中7只大鼠呈典型间情期表现。正常对照动物维持规律性的动情周期，可见阴道分泌物拉丝现象。中药组5只动物维持规律性的动情周期，
2.3 卵巢形态学观察
2.3.1 卵巢大体解剖学改变
正常对照组卵巢色泽红，表面多个红点或紫点；模型组卵巢表面较苍白，体积增大，见较多囊状扩张的卵泡。中药组部分（4/10）表面苍白，部分表面见红紫色斑点。