银杏黄酮苷元对内皮细胞植物血凝素样低密度脂蛋白受体-1表达的影响(一)

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作者：何艳，付永昕，吴立荣，方颖，李安敏，陈云

【摘要】 目的： 探讨银杏黄酮苷元对氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein，ox?LDL)诱导脐静脉内皮细胞株ECV304植物血凝素样低密度脂蛋白受体-1（Lectin?like oxidized low density lipoprotein receptor?1，LOX?1）表达的调节作用。方法： 应用逆转录聚合酶链式反应、SP免疫组织化学法，探讨ox?LDL诱导下内皮细胞表达LOX?1及银杏黄酮苷元的干预作用。结果： 6.25～25 mg/L银杏黄酮苷元与脐静脉内皮细胞株ECV304共同培养6～48 h可显著抑制ox?LDL诱导的内皮细胞LOX?1mRNA和蛋白表达（P0.05），具有浓度、时间效应关系(P0.05)；LOX?1拮抗剂聚肌苷酸可抑制ox?LDL诱导的内皮细胞LOX?1mRNA和蛋白表达(P0.05)。结论： ox?LDL可能通过LOX?1导致内皮功能障碍，银杏黄酮苷元可显著抑制ox?LDL诱导的内皮细胞LOX?1表达，这可能是其抗动脉粥样硬化的机制之一。

【关键词】 受体，LDL； 银杏； 黄酮类； 内皮，血管

　　〔Abstract〕 Objective: To investigate the regulating effects of ginkgetin aglycone (GA) on oxidized low density lipoprotein (ox?LDL) induced gene and protein expression of lectin?like oxidized low density lipoprotein receptor?1 (LOX?1) in human umbilical vein endothelial cell line 304 (ECV304).Methods: RT?PCR and SPimmunohistochemistry assay were used to detect the expression of LOX?1 in endothelial cells under the induction of ox?LDL and the intervention effect of GA. Results: The expression of LOX?1 mRNA and its protein was inhibited significantly when ECV340 cells were incubated with 6.25～25 mg/L GA for 6～48 hours（P0.05）, and to some extend, the inhibitory effect appeared dependant on the drug concentration and action time （P0.05）. LOX?1 receptor inhibitor, polyinosinic acid showed inhibition to the expression of LOX?1 mRNA and protein induced by ox?LDL (P0.05). Conclusions: Endothelial dysfunction could be caused by ox?LDL through LOX?1, and GA can inhibit significantly the expression of ox?LDL induced LOX?1, which may be one of its anti?atherosclerosis mechanisms.

　　〔Key words〕lipoprotein LDL recepters; Ginkgo biloba; flavones; endothelium,vascular

　　氧化型低密度脂蛋白（oxidized low density lipoprotein，ox?LDL）导致内皮功能障碍在动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）病理过程中起关键作用[1]，植物血凝素样低密度脂蛋白受体-1（Lectin?like oxidized low density lipoprotein receptor?1，LOX?1）作为近期发现的主要在内皮细胞表达的ox?LDL特异性受体，介导了ox?LDL对内皮细胞的损伤作用[2]。银杏黄酮苷元（Ginkgetin Aglycone，GA）是通过酸水解-重结晶法去除单糖后获得的新型银杏叶提取物（Ginkgo Biloba Extract，GBE ），与传统GBE比较，GA具有较强的脂溶性和体内生物效价高的特点。目前，国内外对GBE防治动脉粥样硬化的实验研究和临床应用很多，但对GA的研究却很少。本研究在培养的人脐静脉内皮细胞株ECV304上观察了不同浓度GA、作用不同时间对ox?LDL所致的内皮细胞表面LOX?1异常表达的干预，以期为GA进一步用于临床防治AS性疾病提供实验依据。

　　1 材料与方法

　　1．1 试剂及仪器

　　人脐静脉内皮细胞株ECV304（中国典型培养物保藏中心），氧化低密度脂蛋白（中山大学谢志忠博士提供），DMEM培养基（Gibco），聚肌苷酸(Polynosinic ，PIA，Sigma），新生小牛血清（杭州四季青生物工程材料研究所），总RNA提取Trizol试剂及逆转录聚合酶链反应（Reverse transcription?polymerse chain reaction RT?PCR）试剂盒（北京天根生化科技有限公司）， LOX?1兔抗人多克隆抗体（Sata Cruz）；染色体图像分析仪（Leica），梯度PCR仪（Eppendorf公司AG22331型），凝胶图像分析系统（Eppendorf公司AG22331型）；上海捷瑞生物工程有限公司合成下列引物。LOX?1mRNA（193 bp）上游引物：TTA CTC T ATG GTG GTG ，下游引物：AGC TTC TTC TGC TTG TTG ；β?actin mRNA(295 bp)上游引物：5?TCA C ACA ATG TGC A TCT ACG A?3，下游引物：5?CAG CGG AAC CGC TCA TTG A ATG G?3。银杏黄酮苷元（Ginkgetin Aglycone， GA）由贵州省生化中心何照范教授惠赠（主要成分：槲皮素25.75%、山奈酚15.26%、异鼠李素1.77%、总黄酮苷元占总成分含量42.79%），其它试剂均为分析纯。

　　1.2 人脐静脉内皮细胞株ECV304培养

　　人脐静脉内皮细胞株ECV304用10%胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 U/ml硫酸链霉素的DMEM培养液培养，置于37 ℃、5%CO2培养箱中孵育，当细胞生长至80%融合以上时，用体积分数0.25%胰酶消化后，以1∶2或1∶3传代，传代后第2天换液1次，以后每2～3 d换1次液，约3～4 d可长成单层细胞。

　　1.3 实验分组

　　取对数生长期细胞，随机分为对照组（培养基）、ox?LDL组（培养基中加入终浓度为50 mg/L的ox?LDL后继续培养24 h）、银杏黄酮苷元浓度效应组（GA 6.25 mg/L、12.5 mg/L、25 mg/L、50 mg/L预先培养48 h，然后加入终浓度为50 mg/L的ox?LDL培养24 h）、银杏黄酮苷元时间效应组（GA 25 mg/L预先分别作用6、12、24 h后，加入终浓度为50 mg/L的ox?LDL培养24 h）和LOX?1拮抗剂组（PIA250 mg/L预先作用2 h后，加入终浓度为50 mg/L的ox?LDL培养24 h）。

　　1.4 形态学观察

　　相差显微镜观察各组内皮细胞形态变化。

　　1.5 LOX1mRNA测定

　　样品总RNA提取采用Trizol试剂盒，操作按试剂盒说明进行。A260/A280测定RNA浓度和纯度。采用二步法逆转录试剂盒，将RNA逆转录成cDNA作为模板进行扩增。PCR反应条件均为94 ℃预变形5 min，94 ℃变性30 s，55.4 ℃退火40 s，72 ℃延伸1 min，循环40次，最后72 ℃延伸10 min，反应终产物立即进行电泳跑胶，凝胶图像分析电泳结果并照相，测定各条带吸光度值。以恒定表达的β?actin mRNA作为内参进行校正，计算相对表达量。实验重复3次。