PPAR-γ抑制剂T0070907对人鼻咽癌细胞的生长抑制作用(一)

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作者：孙月丽 吴明玮 曾昭蕾 孙健 蔡于琛 冼励坚 赵擎宇

【摘要】 【目的】 探讨PPAR-γ选择性抑制剂T0070907影响鼻咽癌(NPC)细胞体外生长的作用机制。【方法】 通过RT-PCR和Western blotting检测PPAR-γ受体在5株NPC细胞株(E1、E2、HONE1、SUNE1和5-8F)中mRNA和蛋白水平的表达;MTT法检测T0070907对NPC细胞生长情况的影响;流式细胞术和Western blotting检测T0070907对NPC细胞的细胞周期和细胞周期相关蛋白表达的影响。【结果】 PPAR-γ在5株NPC细胞中均有表达;T0070907对NPC细胞株有明显生长抑制作用，并呈浓度、时间依赖性;T0070907作用于NPC细胞E1和E2后，G2/M期细胞比例则逐渐增加，且随着处理浓度的增加而增加，各组间差异有统计学意义(P 0.05)。此外，随着T0070907处理浓度的增加，NPC细胞的细胞周期相关蛋白Cyclin A、Cyclin B1、Cdc2、Cdk2蛋白的表达逐渐下降，无活性的pCdc2蛋白表达则逐渐增强。【结论】 PPAR-γ抑制剂T0070907能够抑制NPC细胞PPAR-γ的蛋白表达，并通过对细胞周期相关蛋白Cyclin A、Cyclin B1、Cdc2、Cdk2、pCdc2等蛋白的调控导致细胞周期G2/M期阻滞，从而抑制NPC细胞的生长。

【关键词】 PPAR-γ; 鼻咽癌; T0070907; 细胞周期; G2/M期

　Abstract： 【Objective】 PPAR-γ (peroxisome proliferator-activated receptor-γ) antagonists have been documented to induce cancer cell proliferation inhibition and apoptosis. In the present study PPAR-γ’s effect on cell growth of NPC cell lines and the possible mechanism was investigated via its selective inhibitor T0070907. 【Methods】 PPAR-γ mRNA and protein expression in five human NPC cell lines (E1， E2， HONE1， SUNE1， and 5-8F) was detected with RT-PCR and Western blotting analysis. NPC cells growth inhibition by T0070907 was measured by MTT assay， and cell cycle arrest of NPC cells treated with T0070907 was assayed by fluorescence-activated cell sorter (FACS) analysis. Cell cycle-associated protein expression was detected by Western blotting. 【Results】 PPAR-γ was expressed both at mRNA and protein levels in five NPC cell lines. NPC cells’ proliferation was significantly inhibited by T0070907， and the growth inhibition was dose- and time-dependent. E1 and E2 cells treated for 48 h with T0070907 markedly aumulated dose-dependently in the phase of G2/M， while they differed significantly (P 0.05) in the phase as well. T0070907 suppressed expression of cell cycle-related proteins including Cyclin A， Cyclin B1， Cdc2， and Cdk2 but increased pCdc2 expression. 【Conclusion】 PPAR-γ inhibitor T0070907 could induce proliferation inhibition of NPC cells to the phase of G2/M， and this cell cycle arrest might result probably from regulation of Cyclin A， Cyclin B1， Cdc2， Cdk2， and pCdc2.

　　过氧化物酶体增殖物激活受体γ(peroxisome proliferator-activated receptor γ，PPAR-γ)属于细胞核受体超家族成员，PPAR-γ与激活配体结合才能被活化，激活后与维甲类X受体(RXR)结合形成异二聚体，该异二聚体与靶基因启动子的应答元件(peroxisome proliferator response elements， PPREs)结合，同时招募共刺激因子调节靶基因的转录[1]，由此在脂肪形成、糖脂代谢及炎症反应等生物学效应中发挥重要作用[2]。近年来，PPAR-γ与肿瘤的关系成为研究热点。业已证实PPAR-γ在多种恶性肿瘤组织中均有表达，如肺癌、胃癌、结肠癌、前列腺癌及乳腺癌等[3]。许多研究表明，通过抑制PPAR-γ的表达能够抑制诸如肝癌、食管癌等肿瘤细胞的生长，诱导细胞凋亡、引起细胞周期阻滞、降低肿瘤细胞粘附及转移能力[4-7]，提示PPAR-γ可以作为治疗肿瘤的分子靶点之一，但其在我国广东地区高发的鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma，NPC)中的研究仍未有报道。NPC是我国常见的头颈部肿瘤，95%以上为低分化鳞癌和未分化癌，恶性程度高，生长快，易发生转移，75%患者确诊时已属晚期，单一放疗对于晚期患者疗效欠佳[8]，目前化疗成为晚期NPC治疗的主要手段之一，但现有化疗疗效不尽人意，分子靶向药物的发展为NPC的治疗带来新的机遇，为此我们选择PPAR-γ抑制剂T0070907进行研究，探讨其作为治疗NPC分子靶向药物的可能性。T0070907是一种新型合成的PPAR-γ抑制剂，化学式为C12H8ClN3O3，对PPAR-γ具有较强的亲和力和较高的选择性，通过影响PPAR-γ配体结合域第12螺旋的构象调节PPAR-γ和共刺激因子的相互作用而抑制PPAR-γ的活化[9]，且其毒性较小[10]。

　　1 材料与方法

　　1.1 试剂及仪器

　　RPMI-1640培养液由中山大学肿瘤防治中心实验研究部配制，胎牛血清(foetal calf serum，FCS)购自杭州四季青公司;T0070907为美国Cayman公司产品，MTT(3-[4，5-dimethylthiazol-2-yl]-2，5-diphenyl tetrazolium bromide)为Sigma公司产品;Trizol为美国Invitrogen公司产品，RT一链合成试剂盒及PCR Mix Perfectshot Taq为大连宝生物有限公司(Takara公司)产品;兔抗人PPAR-γ、Cdk2、Cyclin A、pCdc2多克隆抗体及鼠抗人Cyclin B1、Cdc2单克隆抗体为Santa Cruz公司产品;Thermo Multiskan MK3酶联免疫检测仪来自Thermo公司，FACScaliber流式细胞仪购自美国BD公司，垂直电泳仪、电转装置及凝胶图像分析仪为Bio-Rad公司产品。

　　1.2 细胞培养

　　人NPC细胞株E1、E2、SUNE1、HONE1及5-8F由中山大学肿瘤防治中心实验研究部提供，其中E1、E2分别代表高分化和低分化NPC细胞株，HONE1代表EBV+的NPC细胞株;SUNE1代表高转移性NPC细胞株;5-8F为SUNE1的亚株，具有高转移性，高成瘤性。所有细胞用含100 mL/L胎牛血清、100 U/mL青霉素、100 μg/mL链霉素的RPMI-1640培养基在37 ℃、体积分数5%CO2条件下培养。细胞呈单层贴壁生长，细胞倍增时间约是48 h。所有实验均在细胞对数生长期进行。

　　1.3 RT-PCR法检测PPAR-γ mRNA的表达

　　用Trizol法分别提取各细胞总RNA，紫外分光光度法鉴定其浓度，取2 μg RNA进行逆转录，以GAPDH基因的表达作为内参照进行PCR扩增，每个样本重复3次。实验结果以均数表示。PPAR-γ基因片段(474 bp)引物序列：上游为5＇-TCTCTGTAATGGAAGA-3＇，下游为5＇-GCAT TATGAGACATAC-3＇;GAPDH基因片段(322 bp)引物上游序列为：5＇-CGGGAAGCTTGTCAT CAAT GG-3＇，下游为5＇-GGCAGTGATGGCATGGA CTG-3＇。PCR反应条件：95 ℃预变性3 min;然后94 ℃ 30 s，60 ℃ 40 s，72 ℃ 45 s共30个循环;最后72 ℃延伸7 min。取反应产物5 μL，在溴乙锭染色、1.5%的琼脂糖凝胶下130 V电泳30 min，在紫外凝胶成像仪下观察并拍照。

　　1.4 Western blot检测PPAR-γ蛋白及细胞周期相关蛋白的表达

　　收集对数生长期细胞，加入2 × SDS细胞裂解液提取细胞总蛋白，用紫外分光光度法检测蛋白浓度。调整蛋白浓度，用8%的十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行分离，然后转移至硝酸纤维素膜上，50 mL/L的脱脂牛奶封闭2 h，加入PPAR-γ、Cyclin A、Cyclin B1、Cdc2、Cdk2、pCdc2及GAPDH一抗(1：200)，4 ℃电动摇床孵育过夜，用三羟甲基氨基甲烷缓冲盐水(tris-buffered saline tween 20， TBST)洗膜，加入相应二抗，室温下孵育1 h，TBST洗膜后用ECL试剂盒(Cell Signal公司)感光，冲片，扫描后用Quantity-One软件进行灰度分析。

　　1.5 MTT法检测PPAR-γ抑制剂T0070907对NPC细胞增殖的影响

　　将细胞以每孔2500的密度种植于96孔板，实验分为T0070907组、阳性对照组和阴性对照组。带24 h细胞贴壁后加入药物，阳性对照组加入顺铂(Cisplatin，DDP)，阴性对照组不加任何药物处理。每个浓度设3个平行孔，置37 ℃、体积分数5% CO2条件下培养68 h，然后加入20 μL 5 mg/mL MTT，继续培养4 h，弃培养液，加入200 μL DMSO原液，在微量振荡器上振荡10 min，待完全显色后，用酶联免疫检测仪于570 nm和630 nm波长处测每孔的吸光度值(A值)。Bliss法计算程序求出半数抑制浓度(50% inhibitory concentration， IC50)。按下述公式求出增殖抑制率，抑制率 = (对照组A均值-用药组A均值)/对照组A均值 × 100%。所有实验均重复3次。

　　1.6 流式细胞仪检测细胞周期阻滞情况

　　将NPC细胞以6 × 104/mL接种于6孔板，培养24 h后加入不含血清的不同浓度的T0070907，作用48 h后收集各细胞，用预冷的PBS液洗涤2次，70%冰乙醇固定过夜，514 × g离心10 min，弃去乙醇，再次悬浮于PBS，细胞经碘化丙啶(PI)10 μg/mL染色5 min，4 ℃避光30 min后，在流式细胞仪上检测细胞DNA含量，根据DNA含量在流式细胞仪中得出每份样品的G1、S和G2/M期细胞分布图以及各时期所占比例。LYSIS软件(Becton-Dickinson公司)进行细胞周期分析。

　　1.7 统计学分析

　　用SPSS 10.0统计软件处理数据，采用单因素方差分析进行多个样本均数的比较。统计学处理P 0.05认为差异有统计学意义。