人参皂苷Rg1对AD模型大鼠脑片P?Tau、PKA影响的实验研究(一)

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作者：李玺 张欣 张智燕 袁海峰 权乾坤

【摘要】 目的 研究人参皂苷Rg1对AD模型大鼠脑片磷酸化微管相关蛋白(P?Tau)、蛋白激酶A(PKA)表达的调控作用。方法 采用冈田酸诱导大鼠培养脑片Tau 蛋白过度磷酸化，制备成AD模型，运用免疫组织化学、图像分析技术等方法，观察人参皂苷Rg1对各组大鼠脑片P?Tau、PKA表达的影响。结果 模型组P?Tau、PKA表达水平明显高于空白对照组(P0.01);人参皂苷Rg1各剂量组P?Tau、PKA表达水平虽高于空白对照组，但低于模型组(P0.01或P0.05)，且大、中剂量组优于小剂量组;人参皂苷Rg1呈一定的剂量依赖性下调P?Tau、PKA的表达。结论 人参皂苷Rg1能通过降低P?Tau水平、下调PKA的表达从而减缓神经纤维缠结、老年斑的形成，以发挥抗痴呆的作用。

【关键词】 人参皂苷Rg1 ;阿尔茨海默病;Tau蛋白;蛋白激酶A

　　【Abstract】 Objective To observe the effects of ginsenoside Rg1 on the expressions of P?Tau and PKA on the brain slices of AD model rats. Methods AD models were prepared by culturing rat brain slices with okadaic acid to induce Tau protein hyperphosphorylation. The effects of ginsenoside Rg1 on the expressions of P?Tau and PKA in AD model rat brain slices in each group were observed by immunohistochemistry and image analysis technology. Results The expressions of P?Tau and PKA in model group were significantly higher than those in normal control group(P0.01). The expressions of P?Tau and PKA in Ginsenoside Rg1 groups were significantly lower than those in normal control group, but were higher than those in model group(P0.01 or P0.05), and Ginsenoside Rg1 showed a dose?dependent reduction P?Tau, PKA expression. Conclusions Ginsenoside Rg1 plays the role of anti?dementia through inhibiting the expressions of P?Tau and PKA and slowing the formation of neurofibrillary tangles.

　　【Key words】 Gensenoside Rg1;Alzheimer＇s disease;Protein Tau;cAMP?dependent kinase A

　　 人参皂苷Rg1是从人参中提取的一类生物活性成分〔1〕，有增强记忆和认知功能的作用，已成为研究中药抗痴呆的热点之一。磷酸化微管相关蛋白(Protein Tau，P?Tau)存在于正常人的大脑中，但是Tau 蛋白过度磷酸化参与了神经原纤维缠结(neuro fibrillary tangle，NFT)的形成，成为老年性痴呆(Alzheimer disease，AD)的核心病理变化，并且NFT的数目与AD病人的痴呆程度密切相关。研究表明cAMP依赖的蛋白激酶A(cAMP?dependent kinase，PKA)是导致Tau蛋白发生磷酸化的关键激酶〔2〕，本实验参照国内外有关文献〔3～5〕，采用冈田酸(okadaic acid，OA)诱导的大鼠培养脑片方法，建立Tau 蛋白过度磷酸化的AD模型，观察人参皂苷Rg1对P?Tau、PKA的调控作用，旨在阐明人参皂苷Rg1抗痴呆作用机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 材料

　　1.1.1 实验动物 雄性Wistar大鼠10只，均清洁级(西安交通大学医学院实验动物中心提供)。鼠龄：4～5 w。体重：110～130 g。每只鼠取400 μm厚海马及皮层脑片5张，随机分为5组：空白对照组，模型组，人参皂苷Rg1大、中、小剂量组(每组10张脑片)。

　　1.1.2 药物与试剂 人参皂苷Rg1购自吉林宏久生物科技股份有限公司，纯度98.99%，使用前溶于生理盐水配成浓度分别为60 mg/ml、120 mg/ml和240 mg/ml的三种溶液。OA购自美国ALEXIS生物制剂公司，纯度98% ，使用前溶于10%二甲基亚砜(dimethy sulphoxide，DMSO)，配制成1 mg/ml DMSO溶液待用。P?Tau和PKA多克隆抗体及免疫组织化学试剂盒(SABC)购自武汉博士德生物工程有限公司。

　　1.2 方法

　　1.2.1 动物模型的建立

　　1.2.1.1 离体海马脑片的制备 大鼠在6%水合氯醛(400 mg/kg)麻醉下切开头皮,暴露颅骨,迅速断头，取脑，置于0～4℃经95% O2和5% CO2混合气体饱和的人工脑脊液冰水混合物中,洗净血液并降温后，用振动切片机以振幅8档，速度3档行冠状切片切3～4片海马脑片，厚度400 μm 。然后取海马及皮层脑片，挑选形态较好的脑片置入盛有人工脑脊液的6孔板中培养，温度(32.0±0.5)℃中孵育1～2 h，整个过程持续通入混合氧气(95%O2+5% CO2)。人工脑脊液成分：(mmol/L)(150 NaCl，2 CaCl2，1.2 MgSO4，0.5 KH2PO4，1.5 K2HPO4，10 glucose，pH7.4) 。

　　1.2.1.2 离体海马脑片的分组 空白对照组、模型组、 人参皂苷Rg1大、中、小剂量组脑片开始均培养于人工脑脊液中不做任何处理，1 h后人参皂苷大、中、小剂量组分别加入浓度为60、120、240 μmol/L的人参皂苷Rg1。培养至3 h时，模型组和各药物干预组分别加入OA至其浓度达到1 μmol/L。至6 h时，取出脑片。