乳腺癌患者RASSF1A基因启动子区甲基化及临床意义(一)

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【摘要】 目的 探讨乳腺癌组织中RASSF1A（RAS association domain family 1A）基因启动子区CPG岛甲基化状态及临床意义。方法 用甲基化特异性PCR（MSP）检测40份乳腺癌组织和24份正常乳腺组织中RASSF1A基因启动子区甲基化状态。结果 乳腺癌组织中RASSF1A基因启动子区CPG岛甲基化率为45.0%（18/40），与正常乳腺组织比较差异有显著性(2/24)（P0.05），但与肿瘤病理类型、患者年龄、有无淋巴结转移的差异无显著性（P>0.05）。结论 RASSF1A基因启动子区在乳腺癌中发生异常甲基化，为乳腺癌的候选基因。

　　【关键词】 乳腺癌； RASSF1A基因；基因甲基化；甲基化特异性PCR

　　Promoter methylation of RASSF1A gene in breast cancer patients and its clinical significance

　　【Abstract】 Objective To investigate the methylation status of the CPG islands in the promoter regions of RASSF1A gene and to analyze its clinical significance in breast cancer patients.Methods Methylation status of RASSF1A promoter was detected by MSP in 40 cases of breast cancer tissues and 24 cases of matched benign tissues. Results The frequency of promoter methylation of RASSF1A gene in tumor tissues was 45.0%(18/40),which was significantly higher than in benign tissues(8.3%,2/24)(P0.05).But no significant association of abnormal methylation was identified with histological type ,the patient’s age ,clinical features such as lymph node metastasis. Conclusion Our findings showed that there was hypermethylation of CPG islands in the promoter area of RASSF1A in breast cancer .So RASSF1A gene may be one of the new candidates of tumour suppressor genes.

　　【Key words】 breast cancer; RASS domain family 1A gene;gene methylation; methylation special PCR (MSP)

　　RASSF1A是RAS相关结构域家族基因1（RAS associated domain family gene）的A转录产物，是一种与肿瘤相关的基因，该基因定位于染色体3p21.3区段，编码一组RAS效应蛋白〔1〕，已有报道显示RASSF1A基因在正常组织中广泛表达，但在肺癌、膀胱癌等多种肿瘤组织中却出现表达缺失〔2〕。因此认为RASSF1A基因的失活可能与肿瘤的发生有关。乳腺癌是由乳腺导管上皮发生的恶性肿瘤，是妇女的常见恶性肿瘤之一，在我国，乳腺癌占女性恶性肿瘤的前二位。乳腺癌的发生机制尚不清楚，尚没有良好的治疗方法，有关人体乳腺癌组织中的甲基化状态与临床病理的关系较少见报道。随着表遗传学研究的发展，发现抑癌基因启动子区的甲基化是抑癌基因失活的主要机制之一。我们应用甲基化特异性PCR（MSP）检测乳腺癌组织RASSF1A基因启动子CPG岛甲基化状态，分析其与临床的关系，以期进一步探讨乳腺癌的发生机制并寻找乳腺癌治疗的新方法。

　　1 材料与方法

　　1.1 标本来源 乳腺癌标本40份(乳腺浸润性导管癌 34份，乳腺浸润性小叶癌2份，导管内癌2份，小叶原位癌2份)，年龄24～71岁；对照标本为距肿瘤边缘2cm外正常组织24份，年龄25～68岁，标本均来自深圳北大医院病理科2005年1～11月保存的蜡块标本。经40g/L多聚甲醛固定，常规石蜡包埋，HE染色确诊。患者术前未行放射治疗或化学药物治疗。所有病例均经组织病理学检查确诊。

　　1.２ 试剂与仪器 亚硫酸氢钠、氢醌Sigma公司, DNAzol Reagent、hotstartaq DNA酶Invitrogen公司, Wizard DNA clean-up system Promega公司，PCR扩增仪9700美国ABI公司。

　　1.3 方法 将组织块切成10μm薄片，每份取4～5片放入1.5ml离心管中，加1ml二甲苯，振荡混匀，溶解并尽可能除去石蜡。加1ml无水乙醇，离心去上清。加1ml 75%乙醇漂洗1次〔3〕。每管加1ml DNAzol Reagent，按试剂盒操作抽提DNA。取1～2μg溶于20μl水，加入2.4 μl 3mmol/L NaOH，42℃ 20min,加入新鲜配制的208μl的10mol/L亚硫酸氢钠（pH 5.0）和10mmol/L氢醌12μl混合后，55℃ 16h，取出后，以Wizard DNA clean-up system回收并纯化后，将修饰的DNA置于溶于20μl水〔4〕。检测RASSF1A启动子甲基化状态，甲基化扩增引物（M）：F 5＇-GTGTTAACGCGTTGCGTATC-3＇, R 5＇-AAGCGAACTAAAAACGA-3＇， 扩增产物长度为94bp;非甲基化扩增引物（U）：F 5＇-TTTGGTTGGAGTGTGTTAATGTG-3＇，R 5＇-CAAAACAAACTAAAAACA-3＇， 扩增产物长度为108 bp〔5〕：引物由上海生工生物公司合成。PCR反应体为25μl,包括磺化修饰后的DNA 2μl,10×buffer 2.5μl, 2.5mmol/L dNTP 2μl, hotstartaq酶1U，上下游引物各0.8μl,去离子水补齐至25μl，PCR反应条件：95℃变性15min,94℃ 30s，54℃ 40s，72℃ 30s，40个循环，72℃延伸10min，PCR产物置4℃待电泳检测，PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳，Goldview染色后，紫外灯下观察结果。

　　1.4 统计学分析 用SPSS10.0统计软件进行统计分析，检测数据用χ2检验。

　　2 结果

　　2.1 甲基化特异性PCR结果 乳腺癌组织提取的DNA分别扩增RASSF1A甲基化和非甲基化PCR产物，结果见图1。40份乳腺癌组织标本中18份RASSF1A有甲基化引物扩增出特异PCR条带,其中15份为部分甲基化，3份为完全甲基化。乳腺癌RASSF1A甲基化频率为45.0%。24份正常乳腺组织中22份无甲基化引物扩增出特异PCR条带，仅非甲基化引物扩增出特异PCR条带。2份有甲基化引物扩增出特异PCR条带。乳腺癌RASSF1A甲基化频率与正常乳腺组织的比较差异有统计学意义（P0.05）。