金银花二氧化碳超临界萃取物的体外抑菌作用研究(一)
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作者：苏香萍 龚大春 张亚雄 龚美珍
【摘要】 目的研究金银花CO2超临界萃取(SFE)物的体外抑菌作用。方法采用琼脂扩散法和试管稀释法研究金银花的5种提取工艺，即SFE萃取、SFE-C萃取(C表示带夹带剂)、乙醇提取、超声波提取、共水蒸馏（SD）法提取，所得提取原液药物对6种细菌，即金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、白色葡萄球菌、绿脓杆菌、鼠伤寒沙门氏菌的抑菌作用。结果5种提取原液药物对6种细菌均有一定抑制作用，而且SFE萃取物对绿脓杆菌的MIC 为1∶16；SFE-C萃取物对金黄色葡萄球菌和绿脓杆菌的 MIC 均为1∶16。结论与传统的提取方法相比，采用SFE-C和SFE工艺得到的萃取物含非绿原酸类热敏抗菌物质，提高了金银花的抗菌效果。
【关键词】 金银花 二氧化碳超临界萃取 夹带剂 体外抑菌
Abstract：ObjectiveTo research the growth inhibition of CO2-SFE extracts from Lonicerae on bacteria in vitro. MethodsThe agar diffusion and tube dilution methods were used to study the growth on bacteria inhibition of the Lonicerae extracts with five different kinds of extraction approaches, which were SFE extraction, SFE-C extraction, alcohol extraction, ultrasonic extraction and SD extraction, by applying them to the following bacteria: Staphylocous aureus, Escherichia coli, Bacillus subtilis, Staphylocous albus, Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhimurium. ResultsAll Lonicerae extracts with five kinds of extractions were effective to the bacteria;the MIC against Pseudomonas aeruginosa of SFE extracts was 1∶16；The MIC against Staphylocous aurous and Pseudomonas aeruginosa of SFE-C extracts was 1∶16. Conclusionpared with the conventional extractions methods, the extracts with SFE-C extraction and SFE extraction include the heat-sensitive substances which would enhance the inhibiting bacteria ability.
Key words：Lonicerae; CO2 Supercritical extraction; Cosolvent; In vitro inhibition
金银花为忍冬科Caprifoliaceae忍冬属Lonicera植物的干燥花蕾或带初开的花，为中医常用药，具有清热解毒、凉风散热之功效〔1〕。现代药理研究表明金银花具有较为广泛的药理作用，如抗菌、抗病毒、抗炎解热、保肝、抗生育、抗氧化、止血等，这些研究为金银花的临床用药提供了科学依据，但所确定的有效部位均是水提取物或醇提取物〔2，3〕，有效成分不够明确和具体，因此难以建立有效的质量控制方法。
针对以上不足，我们采用不同的提取工艺，对金银花加入夹带剂CO2超临界（SFE-C）萃取〔4〕、未加夹带剂CO2超临界(SFE)萃取〔5〕、乙醇醇提取〔6〕、超声波提取、共水蒸馏法（SD）提取〔7〕5种提取原液药物中的挥发油类、黄酮类及绿原酸类成分分别进行了富集处理，采用琼脂扩散法和试管稀释法对各个提取物进行了体外抑菌实验研究。
1 仪器与材料
1.1 药品JYH-1(采用SFE-C工艺提取物，其中JYH-X表示第x种金银花提取物，后面括号给出提取工艺说明)：山东产金银花药材，烘干，研碎，再放入萃取釜，加入夹带剂，在35 ℃下，萃取 2 h，将萃取物中溶剂夹带剂旋转蒸发除掉得到萃取物（萃取率为18.61 ％，绿原酸得率为 69.52 ％）。
1.1.1 JYH-2(SFE萃取物)山东产金银花药材，烘干，研碎，再放入萃取釜中，在萃取温度为 35 ℃下，萃取时间 2 h，得萃取物挥发油（萃取率为1.08 ％）。
1.1.2 JYH-3(醇提绿原酸)山东产金银花药材，烘干，研碎，10倍量的75 ％ 乙醇回流2次，60℃，0.5 h/次，再回收乙醇，水浴浓缩，蒸馏水洗入100 ml容量瓶，定容得到绿原酸提取物（得率为79.43 ％）。
1.1.3 JYH-4(超声波提取黄酮)山东产金银花药材，烘干，研碎，放入锥形瓶中，加入95 % 乙醇50 ml，在冰水浴中用超声波振荡器振荡20 min，将提取液过滤至100 ml容量瓶中，残渣再重复振荡提取2次，将3次的滤液合并，在水浴上减压蒸馏得到黄酮提取物（黄酮的含量为0.002 9%）。
1.1.4 JYH-5(SD法提取挥发油)取金银花适量，参照2005年版《中国药典》Ⅰ部的方法用水蒸气蒸馏法提取金银花挥发油，提取时间6 h，得到金银花挥发油（得率为 0.025%）。
1.2 培养基
1.2.1 固体培养基 牛肉膏蛋白胨细菌培养基：蛋白胨10.0 g，牛肉提取物3.0 g，氯化钠5.0 g，琼脂15.0 g，蒸馏水1 000 ml，pH 7.0。
1.2.2 肉汤培养基蛋白胨10.0 g，牛肉提取物3.0 g，氯化钠5.0 g，蒸馏水1 000 ml，pH 7.0。
1.3 菌株所用菌株包括由浙江工业大学生物制药研究所提供的金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌以及由中国科学院微生物研究所购得的绿脓杆菌、白色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌共6种。