HPLC法测定valrubicin膀胱滴注液的含量及有关物质(一)

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【摘要】 目的 建立合适的高效液相色谱法测定valrubicin膀胱滴注液中valrubicin的含量及有关物质。方法 采用岛津Shim-pack VP-ODS色谱柱；流动相为0.015mol/L磷酸溶液(取磷酸1ml，加水稀释至1000ml)∶乙腈(43∶57)；柱温35℃；检测波长254nm；流速1.5ml/min。结果 主药与杂质和或降解产物良好分离，空白油辅料无干扰。以本法检测样品中所含0.05%～10%范围的有关物质，其线性关系良好；在0.01～1.18mg/ml范围内valrubicin浓度与峰面积呈良好的线性关系，适合于含量测定。有关物质检测的LOD为0.1μg/ml，相当于可检出所有浓度低至0.01%的杂质和或降解产物。有关物质检测结果重复性好；含量测定重复性试验测得valrubicin平均含量为96.8%(RSD=0.34%，n=9)。Valrubicin含量测定的平均回收率为100.5%(RSD=0.4%，n=9)。结论 本法色谱性能明显优于USP个论方法，专属性强，更适用于valrubicin膀胱滴注液的含量测定和有关物质检测。

【关键词】 Valrubicin； 膀胱滴注液； 高效液相色谱法； 含量测定； 有关物质

ABSTRACT Objective To establish an alternative high performance liquid chromatography method for the determination of valrubicin and its related substances in valrubicin intravesical solution. Methods TheHPLC method was applied with a Shimadzu Shim-pack VP-ODS (4.6mm×150mm, 5μm) column by anelution system consisted of 0.015 mol/L phosphate acid solution (phosphate acid 1ml added to 1000ml water)∶acetonitrile (43∶57); the flow rate was 1.5 ml/min. The detective wavelength was set at UV 210nm; the column temperature was hold at 35℃. Results The good resolution between peaks of valrubicin and the adjacent impurity and/or degradation product was achieved. The blank excipient consisted of polyoxyl 35 castor oil and ethanol (50∶50) did not interfere in the separation and detection of valrubicin. The linear range for analysis of the related substances of valrubicin in intravesical solution samples was 0.05%～10%, and the linear range for valrubicin assaying was 0.01～1.18 mg/ml. The LOD of the related substances of valrubicin in simulated samples spiked with the blank excipient was 0.1 μg/ml. The average recovery of the method was 100.5% with RSD of 0.4% (n=9); and the average content 96.8% was obtained from the precision test with RSD of 0.3% (n=9). Conclusion The method showed much higher chromatographic performance and specificity than the USP monographic method. It＇s sensitive, precise, aurate and robust for assay and impurity analysis. It＇s more suitable for the determination of valrubicin and its related substances in valrubicin intravesical solution.

KEY WORDS Valrubicin; Intravesical solution; HPLC; Content determination; Related substance

Valrubicin(戊柔比星，AD32)是多柔比星(曾译阿霉素)的一个半合成同系物，属水溶性蒽环类抗生素，能迅速穿透细胞膜并在胞浆中积蓄，治疗效果好且毒性小，已被用于治疗浅表性膀胱癌。Valrubicin膀胱滴注液〔1〕系valrubicin加Polyoxyl 35 Castor Oil〔2〕和无水乙醇(1∶1)制成的无菌油性溶液，临床上通过膀胱内滴注给药，用于卡介菌治疗无效或复发的膀胱原位癌的治疗，疗效明显且耐受性好，USP28版收载了该品的质量标准〔3〕。我们对国产试制样品进行质量研究时发现，USP个论方法尚不完善，被测物色谱行为不理想，该法的系统性能与适用性受到质疑；本文在充分论证的基础上，建立了替代的HPLC色谱分析方法，用于该品的有关物质检测与含量测定，取得了满意的试验结果。

1 仪器与试药

Agilent 1100型组合式全自动高效液相色谱仪，包括Agilent G1315B DAD检测器、Agilent G1313A ALS自动进样器及配套的Agilent Chemstation for LC 3D化学工作站(Rev.A.10.02)；电子分析天平为Sartorius BP 211D型；色谱柱为岛津公司Shim-pack VP-ODS柱(4.6mm×150mm，5μm)。

乙腈为色谱纯；磷酸、盐酸、氢氧化钠、30%浓过氧化氢溶液均为分析纯；水为重蒸水。Valrubicin膀胱滴注液试制样品四批(规格为5ml∶200mg，批号分别为040801、040901、040902和040903)、valrubicin工作对照品(批号为200407，有效含量为98.0%)、valrubicin粗品和中间体(碘代物)均由浙江海正药业股份有限公司提供。

2 方法与结果

2.1 测定方法的确立

(1)USP方法的评价 USP28版收载了valrubicin膀胱滴注液。USP个论方法所订色谱系统为：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.1mol/L甲酸铵溶液∶乙腈(55∶45)(用甲酸调节pH值至4.0)为流动相；检测波长254nm；流速2.5ml。首先对上述色谱系统的优劣性和适用性进行性能评价。

取valrubicin工作对照品及中间体(碘代物)，加USP个论方法规定的溶解介质甲醇制成每1ml中含中间体为0.1mg、含valrubicin 1mg的加样试验溶液，量取10μl进样测试，以2.0ml/min的流速洗脱，结果valrubicin远至47.9min才出峰，峰起始处逐渐上抬，峰形有明显前伸；中间体及其引入的其他杂质均与valrubicin分离较好，对检测尚无干扰。

为提高分析速度和改善峰形，反复调试上述色谱系统的流动相比例、流速等色谱参数，当流动相比例调至38∶62、流速降至1.3ml/min时，再取上述加样溶液进样测试，结果主峰之前有一杂质峰与主峰的分离不佳，分离度仅为1.3；降低流速至1.0ml/min，分离度勉强达到1.5；重复进样数次，没有改观。

用内容量移液管量取膀胱滴注液适量，加甲醇溶解并稀释制成约含valrubicin 1mg/ml的溶液，取10μl进样测试，按调整后的流动相比例以1.0ml/min的流速进行洗脱，结果valrubicin峰在12.3min处流出，峰起始处以30～40°角逐渐上抬，峰形明显前伸(Fig.1)。此现象势必影响积分结果的准确性。不过该系统尚能检出一定数量的杂质峰，其中在4.9min处检出了最大杂质峰，在30.8min处检出了色谱保留最强、怀疑与热降解有关的未知物峰。

另取在高温40℃环境下放置10d的膀胱滴注液适量，加甲醇溶解并稀释成约含valrubicin 1mg/ml的溶液，取10μl进样测试，按调整后的流动相比例进行试验，结果valrubicin峰形与前述现象一致，并发现2.7、4.9和30.9min处的热降解物峰明显增大。再取经60℃放置10d的样品，同法试验，结果发现2.7、4.9和30.9min处的热降解物峰又有更明显增大。

因valrubicin色谱峰形的非对称前伸现象过于明显且始终无法消除(Fig.1已是USP个论方法优化后所能获得的最佳图谱)，故放弃USP28版个论的色谱分析方法，改用下述替代的HPLC法继续进行研究。

(2)替代的HPLC法

色谱条件 用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；以0.015mol/L磷酸溶液(取磷酸1ml，加水稀释至1000ml)∶乙腈(43∶57)为流动相；柱温35℃；检测波长254nm；流速为1.5ml/min。

取本品进行预试验，结果获得了理想的valrubicin色谱峰，主峰与杂质、辅料的分离效果也十分理想，并同样能检出一个相对保留时间接近于主峰3倍的热降解物峰(Fig.2)，故以上述色谱条件为基础建立膀胱滴注液有关物质检测和含量测定的HPLC法。

有关物质检测方法的建立 取本品5ml，置200ml容量瓶中，加流动相稀释至刻度，即得供试品溶液；精密量取1ml，置100ml容量瓶中，加流动相稀释至刻度，即得自身对照溶液。精密量取上述两种溶液各10μl进样测试，记录色谱图至主成分峰保留时间的3倍。

含量测定方法的建立 在有关物质检测方法的基础上发展制订了本品的含量测定方法。用内容量移液管精密量取本品适量(约相当于valrubicin 200mg)，

置200ml容量瓶中，用流动相分数次洗涤移液管内壁，洗液并入容量瓶中，加流动相稀释至刻度，再精密量取5ml，置25ml容量瓶中，加流动相稀释至刻度，摇匀，精密量取10μl进样测定；另取valrubicin工作对照品，同法测定。按外标法以峰面积计算供试品中valrubicin(C34H36F3NO13)的含量。

2.2 方法的验证

(1)溶解介质的比较和选择 曾试验以乙腈为介质制备试验溶液，但发现本品的乙腈溶液呈轻度浑浊，滤膜过滤未见效，故不选用。因USP个论方法规定用甲醇制备试验溶液，故又取甲醇进行试验，结果发现其溶解效果要明显好于乙腈，溶液基本澄清，但仍觉不够清澈透明，滤膜过滤无明显改观。考虑到乙腈、甲醇在反相色谱系统中均属强溶剂，易引发溶剂效应，而valrubicin本身对溶剂效应相当敏感，溶解介质与流动相之间的差异越大，对色谱行为的影响越明显，故决定采用新配的、与上机进柱的流动相完全一致的流动相作为溶解介质制备试验溶液。