动物及健康人肠道共生的大肠埃希菌耐药性及产生原因分析(一)
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作者：李景云 崔生辉 马越 胡昌勤
【摘要】 目的 了解目前动物和人肠道共生的大肠埃希菌耐药性，分析其产生的原因。方法 从甘肃、湖北、北京、山东、四川等地相对封闭的养殖场及养殖场附近的健康人群采集鸡、猪、鱼、人粪便样本，分离大肠埃希菌。用API20E鉴定条鉴定怀疑为大肠埃希菌的菌种，采用KB纸片法检测生化鉴定为大肠埃希菌的菌株的耐药性，利用WHO5.3软件进行药敏试验数据分析。用脉冲场凝胶电泳技术检测具有相似耐药谱型的大肠埃希菌菌株间的同源性。结果 ①共收集571株大肠埃希菌，其中从海水养殖鱼类和淡水养殖鱼类分离31株，另从海水养殖鱼类和淡水养殖鱼类分离嗜水气单胞菌株57株；②来源鸡的大肠埃希菌对所有检测的抗菌药物的耐药率最高；③除β?内酰胺类抗生素和阿米卡星外，鸡、猪和人来源菌株的耐药率表现为高、中、低现象，对老的一些抗菌药物和喹诺酮类抗菌药物尤其明显；不同地区分离株的耐药性也有较大的差异；④本次调查首次在国内养鸡场发现产ESBL大肠埃希菌，并且非常多见；⑤嗜水气单胞菌和大肠埃希菌的耐药性有较大的差异，47株耐药谱型相近的菌株中发现了三组基因水平同源性菌株(相似度大于95%)。结论 ①从不同地区、不同种类动物分离菌株的耐药性不同，与抗生素的使用情况相关。目前我国家禽养殖业滥用喹诺酮类和β?内酰胺类尤其是三代头孢菌素类抗生素的现象较为普遍，应该加以严格控制；②不同菌种的生物学特性不同，导致耐药性不同；③同源性分析发现耐药菌株可在同一种类动物间传播，不同类动物的大肠埃希菌之间可能存在耐药基因的水平传播；④应当加强养殖动物分离的大肠埃希菌耐药性监测。
【关键词】 大肠埃希菌； 养殖场； 抗生素； 耐药性
ABSTRACT Objectives To investigate the resistant profiles of Escherichia coli, the mensal intestinal isolates from pig, chicken, fish and healthy human beings. Methods E.coli isolates were recovered from fecal specimens of chicken, pig, fish and healthy human beings collected from farms of Gansu, Hubei, Shandong, Sichuan and Beijing areas. The isolates were identified by API20E system. The antimicrobial susceptibility of these isolates were tested by K?B disk diffusion method, and the data were analyzed by WHO5.3 software. Pulsed Field Gel Electrophoresis (PFGE) were applied to identify the homogeneity of 47 E.coli isolates which showed similar antimicrobial resistance profiles. Results Totally 571 E.coli isolates were recovered, include 31 seawater and freshwater cultivating fish isolates. Otherwise 57 Aeromonas hydrophila isolated from seawater and freshwater cultivating fish. The chicken isolates showed the highest resistant level pared to isolates from other sources. The antimicrobials susceptibility of the isolates from chicken, pig and human were low,middling and high respectively (except beta?lactams and amikacin). At the same time, the antimicrobials susceptibility of the isolates from five areas were different significantly. The extended?spectrum beta?lactamases (ESBLs) producing E.coli isolates were recovered from poultry farm. The resistant profiles oE.coli and Aeromonas hydrophila isolates collected from fish fecal specimens were different. With PFGE analysis, three group isolates were highly homogeneous. Conclusion Antimicrobial resistance of the isolates were widely distributed in China. The drug?resistant isolates could transmit among animals of the same species, horizontal transfer of resistance genes from E.coli did ourred between animals of different species.It is important to survey antimicrobial susceptibility of the E.coli isolates from livestock farm.
KEY WORDS Escherichia coli; Livestock farm; Antimicrobial; Resistance
细菌耐药性是全球关注的热门话题，近年我国对引起人类疾病临床分离株的研究文献较多，抗菌药物在人类医学领域以外使用造成耐药性灾害的报道不多。畜牧业抗生素的使用导致耐药株的出现，并通过食物链传播给人，对人类健康带来严重威胁〔1〕。为此，国家科技部提供专项基金，由国家食品药品监督管理局细菌耐药性监测中心在我国湖北、山东、甘肃、四川和北京四省一市开展调研，现将对共生于动物及健康人肠道的大肠埃希菌的耐药性及产生的原因报告如下。
1 材料和方法
1.1 标本采集和菌种分离鉴定
(1)样本的采集 2006～2007年在湖北恩施、山东半岛、北京门头沟、甘肃酒泉和四川新都地区各选择2个以上的比较封闭的养鸡场、养猪场和养鱼场，用英国Oxoid公司生产的采样拭子采集鸡、猪、鱼、正常人粪便样本。
(2)细菌的分离鉴定 先采用丹麦血清所生产的肠道菌分离鉴定用琼脂平板进行大肠埃希菌的分离，用北京三药药品生物制品开发公司生产的伊红美兰琼脂平板传纯菌株。纯菌株的鉴定采用法国Bio?Merieux公司的API20E肠杆菌科细菌鉴定条。
1.2 药敏试验
采用KB纸片法，质控菌株为大肠埃希菌AT25922和AT35218由美国疾病控制中心提供。大肠埃希菌和嗜水气单胞菌药敏试验方法与判定标准分别参照美国临床实验室标准化研究所(CLSI)M100?S17〔2〕和M45?A〔3〕。MH琼脂平板购自天津金章科技开发公司。药敏纸片为英国Oxoid产品和北京天坛药物生物技术开发公司的产品，纸片的药物含量参照CLSI标准。产超广谱β?内酰胺酶(ESBLs)菌株的确证采用双纸片法。
1.3 数据分析
药敏试验数据分析采用世界卫生组织细菌耐药性监测中心推荐的WHO5.3软件进行。
1.4 菌株间同源性分析
(1)主要试剂 限制性内切酶XbaI购自大连宝生物公司；SeaKem Gold琼脂糖购自美国Cambrex公司；蛋白酶K为德国Merck公司产品；十二烷基肌氨酸钠、Tris base、EDTA、苯甲基磺酰氟(PMSF)、硼酸等均为美国Sigma公司产品。
(2)主要仪器 脉冲场凝胶电泳仪CHEF Mapper电泳仪和凝胶成像系统Gel/ChemiDoc系统均为BIO?RID公司产品。
(3)PFGE 操作方法参照美国CDC建立的Pulse提供的方法。
(4)数据分析 将PFGE得到的电泳图谱采用BioNumerics软件(ver4.0)进行分析，以不加权成对算术平均法(unweighted pair?group method with arithmetic average，UPGMA)为手段进行聚类分析。
2 结果
2.1 分离菌株的耐药性
从甘肃、湖北、北京、山东、四川四省一市采集鸡、猪、鱼、人粪便样本共分离大肠埃希菌571株，其中从鸡、猪和人粪便样本分离大肠埃希菌共540株，它们对常规监测用抗生素的耐药性和主要耐药谱型分别见表1和表2。从海水养殖鱼类和淡水养殖鱼类共分离嗜水气单胞菌57株和大肠埃希菌31株，其耐药性见表3。
2.2 不同地区动物、人源性大肠埃希菌产超广谱β?内酰胺酶(ESBL)菌株分离情况
经CLSI推荐的确证试验证明本次调查共有65株大肠埃希菌为产ESBL菌株，其中以鸡来源菌株的分离率最高，其次为人源菌株，猪分离菌株未发现产ESBL菌株。不同地区动物、人源性大肠埃希菌产ESBL菌株分离情况见表4。
2.3 耐药性相似的大肠埃希菌菌株同源性分析
采用XbaI作为内切酶，对来自湖北恩施地区和甘肃酒泉地区耐药表型相似的47株大肠埃希菌菌株进行PFGE同源性分析。以95%的相似度为界限，来自同一养鸡场的大肠埃希菌xiao39、xiao27、xiao35，同一养猪场的大肠埃希菌p44和p60和养鸡场周围人群分离的hj18和hj21b分别为同源菌株；47株菌可以分成40个PFGE型别， 在不同动物种群、不同地区间未 表1 五地区鸡、猪和人来源大肠埃希菌对常规监测抗菌药物的耐药性表2 五地区鸡、猪和人来源大肠埃希菌主要耐药谱型比较表3从鱼分离到嗜水气单胞菌和大肠埃希菌表4 不同地区动物/人源性大肠埃希菌产发现同一克隆株。