厄多司坦对博莱霉素致大鼠肺纤维化发生发展的干预作用(一)
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【摘要】 目的:探讨厄多司坦对肺纤维化的干预作用及机制。方法:清洁级雄性SD大鼠24只，随机分为2组：博莱霉素组12只（气管内滴注博来霉素复制肺纤维化模型5mg/kg，0.2～0.3mL)、厄多司坦组12只（造模后用厄多司坦10mg/kg・d灌胃），各组于造模后第7、28d行肺功能检查后各处死6只，观察肺泡炎和肺纤维化的动态变化和肺组织匀浆中羟脯氨酸（HYP）、丙二醛(MDA)、髓过氧化物酶（MPO）含量及超氧化物歧化酶(SOD)活力。结果：①厄多司坦组大鼠肺泡炎、肺纤维化程度减轻，肺功能优于博来霉素组。②28d时肺组织匀浆中HYP含量厄多司坦组（5.93±0.24）显著低于博来霉素组（6.36±0.27）（P0.05）。③7d时肺组织匀浆中MDA、MPO含量厄多司坦组显著低于博来霉素组（P0.01），厄多司坦组SOD活力高于博来霉素组（P0.01），28d时上述各指标两组间无统计学差异(P>0.05）。结论：①厄多司坦对博莱霉素致大鼠肺纤维化有干预作用，②厄多司坦干预肺纤维化的机制早期可能为通过使中性粒细胞扣压减少,增加自由基的清除使体内氧化?抗氧化系统恢复平衡,使脂质过氧化损伤减轻而实现的。
【关键词】 肺纤维化；厄多司坦；羟脯氨酸；自由基；博莱霉素；大鼠
【ABSTRACT】 Objective:To investigate the possible effect and understand mechanisms of erdosteine in pulmonary fibrosis.Method:24 Sprague?Dawley male rats weighting 250±10g were randomly divided into two groups:BLM group twelve rats(Lung fibrosis was induced by intratrached injection of BLMA5 5mg/kg，0.2～0.3mL)、erdosteine group twelve rats（injected erdosteine (10mg/kg) into oesophagus once a day from lung fibrosis to induce sacrifice,killed randomly at 7th day and 28th day(n=6,at each time point)by puncturing heart to obain blood.All rats were analyzed pulmonary function before they were killed and the extent of alveolitis and collagen deposition were obsarved,The left lung tissue homogenate was used to determine the content of HYP、 MDA、 MPO and the activity of SOD of lung tissue.Results：①The degree of alveolitis and fibrosis of erdosteine group was alleviated pared to that of corresponding BLM group significantly（P0.05），and pulmonary function of erdosteine group rats was surpassive significantly in BLM group.②At the 28th day in erdosteine group the content of HYP in lung tissue（μg/mg）was lower significantly than that of corresponding BLM group（P0.05）.③At the 7th day in erdosteine group the content of MDA、MPO in lung tissue（μg/mg）was lower significantly than that of corresponding BLM group、and the activity of SOD in lung tissue (U/mg prot) was higher significantly than that of BLM group（P0.01）,but At 28th day there was no statistic difference(P>0.05）Conclusion:①Erdosteine can cure Bleomycin?induced pulmonary fibrosis in rats.②The possible underlining mechanisms that Erdosteine cure Bleomycin?induced pulmonary fibrosis in rats may decrease neutrophile aumulation,balace oxidation?antioxidation system by reducing free radical production and increasing free radical remove,to alleviate lipid peroxidation damage.
【KEY WORDS】 Pulmonary Fibrosis,Erdosteine,Hydroxyproline,Free Radicals,Bleomycin,Rats
肺间质纤维化（ILF) 是不同类型肺部损伤的晚期病变,早期表现为肺部炎症反应和过度的损伤修复,随后出现成纤维细胞增生、胶原蛋白的含量增加、肺部超微结构和胶原蛋白空间分布异常,最终导致肺泡壁的损伤和微血管功能丧失,预后差，病死率高。厄多司坦是一种新型动力型祛痰药,该药具有降低痰液的黏滞度,溶解黏液,增加黏液纤毛转运,降低痰液与气道壁的黏着力,清除氧自由基和增加痰液中抗生素浓度等作用[1] 。本研究用厄多司坦来干预博莱霉素诱导的肺纤维化大鼠，通过检测大鼠肺功能指标：肺活量、肺顺应性，不同时间点肺泡炎、肺纤维化程度，羟脯氨酸含量，评价其治疗肺纤维化的效果。通过测定肺组织匀浆中超氧化物歧化酶活力，肺组织匀浆中丙二醛的含量及髓过氧化物酶含量，探讨对其肺纤维化可能的作用机制。
1 材料与方法
1.1 实验动物分组、造模及给药方法
健康雄性SD清洁级大鼠24只，体重250 ±10g（由河北省实验动物中心提供）。随机分为2组,博莱霉素组：12只，制造肺纤维化模型，大鼠用10%水合氯醛（40mg/kg）腹腔注射麻醉后，无菌条件下经颈手术,暴露气管，经环甲软骨下气管间隙穿刺，一次性缓慢注入0.2～0.3mL 含BLMA5 (5mg/kg,用生理盐水配成浓度为4mg/L)的生理盐水溶液，注射后立即将大鼠直立并旋转，使药液在肺内分布均匀，缝合切口，覆盖纱布，动物自然清醒后以生理盐水灌胃，直至处死。厄多司坦组：12只，用同法制造肺纤维化模型后以厄多司坦（10mg/kg・d）灌胃，直至处死，各组于造模后第7、28d各处死6只。各组及各时间点的动物处死前均先行肺功能检查。
1.2 动物肺功能检查方法
以10%戊巴比妥钠（50mg/kg）腹腔注射麻醉动物后，将其固定在木板上，在无菌操作下做颈部正中切口，充分暴露气管，并下穿手术线待固定气管插管。在气管下段做一小“T”形切口，将自制的气管插管固定于气管内，然后将麻醉大鼠放入体描箱中，打开肺功能仪各开关，调整各项参数到备用状态后，将气管插管与体描箱中的导管联通，关闭体描箱，行肺功能检查，检查完毕后保存各项数据，待分析肺功能指标：肺活量、肺顺应性。然后将大鼠移出体描箱，放在木板上待取标本。
1.3 试剂与仪器
博来霉素A5粉剂（8mg/支）：天津太河制药厂生产。
厄多司坦片（商品名露畅 150mg/片）：扬子江药业集团公司生产。
SOD、MDA、MPO、HYP测定试剂盒 ：南京建成生物工程研究所。
动物肺功能分析系统： 购于北京贝兰博科技公司。
可见分光光度计 722：上海分析仪器厂。
1.4 标本的留取及处理
动物行肺功能检查完毕后，心脏穿刺取血处死。取右肺中叶置于4%多聚甲醛溶液中浸泡固定24h，之后常规石蜡包埋，切片，进行HE染色和Masson染色，光镜下观察肺组织病理形态学变化，左肺叶冷生理盐水漂洗后立即剪成小块,用手动匀浆仪碾成匀浆,置于-70℃冰箱中保存，待测定MDA、MPO、HYP的含量（具体操作按试剂盒说明书进行）。
2009年6月张 蕾等：厄多司坦对博莱霉素致大鼠肺纤维化发生发展的干预作用第3期2009年6月河北北方学院学报（医学版）第3期1.5 肺泡炎、肺纤维化程度分级
根据Szapiel[2]等的方法，在光镜下观察HE染色和Masson染色病理切片分别评价肺泡炎和肺纤维化的程度，均分为4级。肺泡炎分级：0级：无肺泡炎；1级：轻度肺泡炎，肺泡隔因细胞浸润增宽，病变范围局限在全肺20%以下，肺泡结构正常；2级：中度肺泡炎，病变范围占全肺的20%～50%；3级：重度肺泡炎，成弥漫性分布，病变范围大于50%。肺纤维化分级：0级：无肺纤维化；1级:轻度肺纤维化，受累面积少于全肺20%；2级:中度肺纤维化，受累面积占全肺的20%～50%，肺泡结构紊乱；3级：重度肺纤维化，受累面积大于50%，肺泡融合，肺实质结构紊乱。
1.6 统计学处理
数据资料采用SPSS11.5 统计软件处理。实验结果中计量资料以均数±标准差（x±s）表示；同一时间点组间比较采用t检验；病理等级资料采用非参数秩和检验,以P0.05认为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 一般情况观察
博来霉素组大鼠很快出现精神不振，被毛干枯无光泽，少动，进食少，体重减轻，唇及爪轻度紫绀，第5d死亡一只，约14d后食欲和体重有改善；厄多司坦组大鼠精神状态、进食、活动较博来霉素组好，无死亡，体重增长基本正常。