丹参酮对D?半乳糖?Aβ1?40致痴呆大鼠海马内Aβ和AChE的影响(一)

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【摘要】 目的 探讨丹参酮对D?半乳糖?Aβ1?40致复合痴呆模型大鼠海马内β?淀粉样蛋白(Aβ)和乙酰胆碱酯酶(AChE) 表达的影响。方法 实验动物随机分成AD模型组、丹参酮治疗组和溶媒对照组。采用免疫组织化学和酶组织化学方法，分别观察大鼠海马内Aβ和AChE表达的变化。结果 AD模型组大鼠海马内Aβ?ir细胞数显著增多，平均光密度增强;AChE阳性神经纤维受损，光密度下降 (含阳性面积百分比和光密度);与溶媒对照组比较差异显著(P0.01)。丹参酮处理后，Aβ?ir细胞数明显减少，光密度也下降;AChE阳性神经纤维密度增强，与AD模型组比较差异有显著性意义(P0.01)。结论 丹参酮改善D?半乳糖?Aβ1?40致复合痴呆大鼠学习记忆障碍的作用机制，可能与降低海马内Aβ的表达而保护脑内胆碱能神经有关。

【关键词】 丹参酮;D?半乳糖;β?淀粉样肽蛋白;乙酰胆碱酯酶;海马

【Abstract】 Objective To investigate influence of tanshinone on levels of β?amyloid (Aβ) and acetylcholinesterase (AchE) in hippocampus of dementia model rats induced by D?galactose bination with Aβ1?40.Methods Rats were randomly divided into Alzheimer＇s disease (AD) model, tanshinone treatment, and solvent control groups. The expression of Aβ and AChE in rats hippocampus were respectively observed by immunohistochemical and enzyme?histochemical methods. Results Aβ?ir cells count and the average optical density of AD rats in the hippocampus were obviously increased, AChE positive nervous fibers damaged, optical density of AChE positive nervous fibers were significantly decreased in AD model group pared with solvent control group. After treated with tanshinone, Aβ?ir cells count and the optical density obviously decreased, AChE?positive nervous fibers were significantly increased pared with AD model group. Conclusions Mechanism of tanshinone on improving learning and memory impairment dementia model rats induced by D?galactose bination with Aβ1?40 might be related to decreasing expression of Aβ in hippocampus and protecting cholinergic nerves in brain.

　　【Key words】 Tanshinone; D?galactose; β?amyloid peptide protein (Aβ); Acetylcholinesterase (AChE); Hippocampus

　 阿尔茨海默病(AD)〔1〕是严重影响老年人健康的常见病、多发病，在欧、美等国家已成为继心血管病、肿瘤及中风之后的第4位死亡原因。各种原因导致的中枢神经系统内β?淀粉样前体蛋白(APP)的过多表达，APP被降解导致过量的β?淀粉样蛋白(Aβ)产生是启动AD发病的关键因素。Aβ是AD患者脑内老年斑的主要成分，凝聚态的Aβ具有神经毒性被认为是细胞凋亡过程的诱导因素〔2，3〕。AD患者表现出中枢胆碱能系统功能紊乱，神经递质乙酰胆碱 (ACh) 及其合成酶胆碱乙酰化酶(ChAc)缺失的程度与AD密切相关〔4〕。有报道，丹参酮ⅡA和ⅡB能减少小鼠短暂的 (急性) 局灶性脑缺血的脑梗死灶体积，并可能有神经保护作用〔5〕，还能改善缺血再灌注损伤小鼠和东莨菪碱(抗胆碱药)诱发的空间行为缺陷小鼠的学习、记忆障碍〔6〕。但就丹参酮对D?半乳糖?Aβ1?40诱发复合痴呆(记忆障碍)病变大鼠的作用未见报道。本研究采用腹腔注射1.25% D?半乳糖致衰老加双侧海马微量注射Aβ1?40诱发AD样痴呆 (记忆障碍) 大鼠模型，以观察海马内ACh的降解酶乙酰胆碱酯酶 (AChE) 和Aβ表达的变化，同时观察丹参酮改善大鼠学习记忆障碍的神经化学机制。

　　1 材料与方法

　　1.1 实验动物 雄性SD大鼠45只，鼠龄3～4月，清洁二级，体重250 g左右(华中科技大学同济医学院实验动物学部提供)。实验动物随机分成3组：AD模型组15只;丹参酮治疗组20只;溶媒对照组10只。

　　1.2 主要试剂及仪器 Aβ1?40、DAB (Sigma公司，美国)，Aβ?SP免疫组织化学试剂盒(ZYMED公司，USA)，生物素标记羊抗兔IgG工作液、辣根酶标记链霉卵白素 (S?A/HRP) 工作液 (北京中山生物有限公司)，丹参酮 (华中科技大学同济医学院临床药理学教研室惠赠)。江湾Ⅰ型脑立体定位仪 (上海川沙花木农机厂)，Y?型水迷宫(中国医学科学院药物所研制)，AO恒冷箱切片机(AO公司,美国)，HPIAS?1000彩色病理图文分析系统(华中科技大学同济医学院清屏影像工程公司组装)。

　　1.3 造模方法 全部大鼠在实验前应用Y?型水迷宫进行学习记忆功能的检测，选取学习记忆功能正常的大鼠随机配组实验;每组动物造模完成后，分别采用水迷宫试验鉴定动物模型。

　　1.3.1 实验动物学习记忆功能的测试 采用Y?型水迷宫试验监测大鼠学习记忆功能。记录大鼠平均逃避潜伏期 (从入水起点至寻找到阶梯出水的时间) 和进入盲端的错误次数 (逃避错误频率，次/3 min)。预训练4 d，每天2次，每次训练时间定为3 min，3 min仍未找到安全通道者以180 s计算。训练第1天让大鼠自由游泳，第2～4天训练时，试验者可引导大鼠进入安全通道。按照Zealonga 5级评分法〔7〕，在造模大鼠清醒后，立即进行动物神经功能的评定。评分标准为：正常 (0分);对侧肢体屈曲 (1分);拖鼠尾后拉时，对侧肢体无力(2分);拖鼠尾后拉时，向对侧转圈(3分);自发向对侧转圈或倾倒(4分)。选取评分为2分及以上造模大鼠入围实验。

　　1.3.2 D?半乳糖腹腔注射 参照文献〔8，9〕以无菌生理盐水配制1.25% D?半乳糖溶液。AD模型组和丹参酮治疗组按50 mg・kg-1・d-1的标准计算相应的D?半乳糖盐液量，腹腔注射，连续6 w。溶媒对照组大鼠与AD模型组同法腹腔注射等量的生理盐水。

　　1.3.3 Aβ1?40海马注射 在D?半乳糖连续处理6 w后的第2天，施行Aβ1?40海马注射。大鼠腹腔注射10%水合氯醛 (0.35 g/kg) 麻醉，头顶部去毛，消毒皮肤并切开1.5 cm长切口，暴露颅骨和前囟。用牙科钻头钻开颅骨，在海马齿状回背侧 (参照大鼠脑立体定位图谱，定位坐标为前囟后3.5 mm，脑正中线旁开2.0 mm，深度2.7 mm) 缓慢注入Aβ1?40各1 μl (10 μg Aβ1?40溶于1 μl无菌生理盐水，用前37℃下孵育1 w，使其凝聚老化)。注射完毕后留针5 min(保证溶液充分扩散)，然后缓慢起针。蜡封闭针孔，撒消炎粉止血消炎，缝合皮肤。溶媒对照组大鼠与AD模型组同法，于海马区注射等量的生理盐水1 μl。术后将大鼠放回鼠笼中常规饲养。并肌注青霉素抗感染(40万U/d・只，连续7 d)。丹参酮治疗组在D?半乳糖?Aβ1?40复合造模后24 h，部分模型组大鼠给予丹参酮〔10〕，丹参酮均按50 mg・kg-1・d-1溶于5 ml玉米油中灌胃;溶媒对照组及AD模型组仅以等量玉米油灌胃;各连续14 d。

　　1.4 染色方法 实验大鼠以10%水合氯醛腹腔麻醉，经左心室升主动脉灌注生理盐水100 ml，随即快注冷的4%多聚甲醛固定液 (4℃，pH7.3) 100 ml，然后慢速灌注多聚甲醛液200 ml。开颅取脑，标本入20%、30%蔗糖磷酸缓冲液 (PB 0.1 mol/L，pH7.4) 中，制作海马冠状恒冷箱切片，片厚25 μm，PB接片，收集全部切片，做形态学各项指标检测。

　　1.4.1 Aβ?SP免疫组织化学法 部分切片采用链霉卵白素?生物素复合法进行Aβ免疫染色。切片依次入0.25% Triton X?100，37℃预处理30 min;正常10%小牛血清室温20 min;一抗 (Aβ抗体) 工作液，室温孵育2 h，转入4℃孵育12 h;二抗酶标羊抗兔IgG (HRP?IgG，1∶100)，37℃ 30 min;SP复合物 (S?A/HRP工作液)，37℃ 30 min;DAB/H2O2?硫酸镍铵染色液显色。用PBS替代一级抗体作为阴性对照。每只实验大鼠随机选5张切片，200光镜视野下标定海马切片CA1和CA4区。利用HPIAS?1000彩色图像分析系统分别测定海马各亚区的面积(S)和AChE阳性神经纤维的面积(S＇)(阳性面积百分比：S＇/S)，以及Aβ?ir神经元胞体计数和平均光密度。

　　1.4.2 AChE组织化学法 部分切片入改良的Karnovsky?Roots孵育液，37℃孵育2 h，0.05 mol/L Tris?HCI缓冲液 (pH7.6) 漂洗切片，DAB/H2O2?硫酸镍铵染色液显色。阳性神经纤维呈灰蓝色。

　　1.5 统计方法 所有数据以x±s表示，采用SPSS12.0 统计软件进行单因素方差分析和多组间均数比较。