天然水蛭素对实验性肝纤维化大鼠肝脏结缔组织生长因子 mRNA表达的影响(一)
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作者：贾彦 牛英才 张英博 周丽 董妙先
【摘要】 目的观察水蛭素对肝纤维化大鼠肝脏组织结缔组织生长因子（Connective tissue growth factor, CTGF）mRNA表达的影响。方法SD大鼠60只随机分为空白对照组、模型组和水蛭素组共3组，每组20只，用40%四氯化碳（carbon tetrachloride, l4）复制大鼠肝纤维化模型，水蛭素干预12周后处死大鼠，采用实时荧光定量PCR法检测大鼠肝组织CTGF mRNA的表达。结果模型组CTGF mRNA 2-ΔΔCt值（3.59±0.52）显著高于正常对照组（1.02±0.23）(P0.05)，表明模型组CTGF mRNA表达上调。与模型组比较，水蛭素组CTGF mRNA 2-ΔΔCt值（1.83±0.34）显著降低（P0.05），表明CTGF mRNA表达下调。结论水蛭素可能通过下调CTGF mRNA的表达，抑制肝脏细胞外基质异常增生发挥抗肝纤维化作用。
【关键词】 水蛭素； 肝纤维化； 结缔组织生长因子； 实时荧光定量PCR
Abstract：ObjectiveTo observe the effect of hirudin on CTGF mRNA expression in rat liver in hepatic fibrogenesis induced by carbon tetrachloride (l4). MethodsStudies were conducted in 60 male Sprague-Dawley rats, and they were equally randomly divided into 3 groups with 20 in each, named as blank controls group, model group, and hirudin group. A hepatic fibrosis model on rats was set up with l4(40%). Hirudin were given to the hirudin group fibrotic rats (daily gavage), normal saline was given to the control group and model group rats. After 12 weeks, CTGF mRNA expression in hepatic tissue were detected by real-time quantitative reverse transcription-PCR. Results The CTGF mRNA expression was up-regulated In model groups, in which CTGF mRNA 2-ΔΔCt value were 3.59±0.52 , pared with the blank group (1.02±0.23，P0.05). The CTGF mRNA expression in hirudin group (1.83±0.34) was down-regulated pared with the model group(P0.05).ConclusionHirudin may down-regulate expression of CTGF mRNA and Inhibit the abnormal hyperplasia of hepatic extracellular matrix, so it has the function of antihepaticfibrosis.
Key words：Hirudin; Hepatic fibrosis; Connective tissue growth factor; Real-time quantitative reverse transcription-PCR
肝纤维化是大多数慢性肝病向肝硬化发展的共同病理过程，成因相当复杂，阻断肝纤维化的继续发展，是预防肝硬化的关键〔1〕。肝纤维化的特征是肝细胞增殖和细胞外基质聚集，并需转化生长因子-β1（TGF-β1）参与，CTGF是TGF-β1的下游效应介质，具有介导TGF-β1促细胞外基质沉积的作用，阻断CTGF可抑制TGF-β介导的细胞外基质（Extracellular matrix, ECM）产生〔2〕。多数中医医家认为肝血瘀阻是肝纤维化基本病机，因此用药以活血化瘀为主。水蛭是经典的破血逐瘀类中药。作者利用SYBR Green Ⅰ实时定量RT-PCR技术，建立大鼠肝组织CTGF基因相对表达量的检测方法，观察了水蛭素干预对l4诱导的大鼠肝纤维化肝脏组织中的CTGF基因的影响。
1 材料与仪器
1.1 药物 水蛭素的提取〔3〕：先将宽体金线蛭干制品粉碎，然后加入10倍体积的80%预冷丙酮，4℃搅拌10 min，再加入氯化钠和三氯乙酸，搅拌30 min，然后离心，弃上清液，沉淀中加入其体积1/3的80%冷丙酮，抽提2次，离心，收集上清液，合并两次抽提液加入2倍体积的冷丙酮，静置2h，再离心，弃上清液，收集沉淀，干燥得水蛭素粗品。四氯化碳（l4分析纯）：北京北化精细化学品有限责任公司。
1.2 动物及分组 选用健康雄性清洁级SD大鼠60只，体重（200±10）g，由北京维通利华实验动物技术有限公司提供，许可证编号SCXK（京）2002-0003。经适应性饲养1周，随机分为空白对照组、模型对照组和水蛭素组共3组。
1.3 试剂和仪器SYBR‰ ExScriptTMRT-PCR kit（Perfect Real Time）为TAKARA公司产品，2700型PCR System扩增仪为Applied Biosystems公司产品，UV-2550型紫外分光光度计为日本岛津产品，ABI 7300荧光定量PCR仪为美国ABI公司产品。
2 方法
2.1 肝纤维化模型的建立〔4〕和药物干预 大鼠皮下注射体积比为40%的l4和橄榄油混合液0.2 ml/100 g，每周2次，连续12周。正常组用等量生理盐水皮下注射，水蛭素组在造模同时按60mg・kg-1，1次/d，灌胃给药，连续12周，正常组和模型组给予等体积蒸馏水灌胃，治疗结束后第2天，剖取动物肝脏。
2.2 荧光实时定量PCR检测大鼠肝脏组织CTGF mRNA表达
2.2.1 抽提总RNA 实验结束时（12周末）在戊巴比妥钠麻醉条件下随机每组取5只大鼠处死，取肝脏组织100mg，用RNAiso Reagent（TaKaRa公司）提取总RNA，按RNAiso Reagent操作说明书进行。提取的RNA质量由OD260/OD280比值和2%琼脂糖凝胶电泳鉴定。
2.2.2 引物序列 CTGF引物序列: forward，5＇-CACGGGTTAAATGACAA-3＇；reverse, 5＇-AGCGGTAGGTCTTCACACTG-3＇。GAPDH引物序列：forward，5＇- GACAACTTTGGCATCGTGGA-3＇；reverse，5＇- ATGCAGGGATGATGTTCTGG-3＇。
2.2.3 逆转录反应 在2700型PCR System扩增仪上按SYBR‰ExScriptTMRT-PCR Kit反转录试剂说明书进行cDNA的合成，反应参数为：反转录反应42℃ 15 min，反转录酶的失活反应95℃ 2 min。
2.2.4 PCR反应 PCR反应采用SYBR Premix Ex Taq(Perfect Real Time) kit试剂，在ABI 7300荧光定量PCR仪（美国ABI公司）上进行PCR反应。设置检测文件，反应条件如下：第一步是预变性，95℃预变性10 s，共1个循环。第二步是PCR反应，95℃变性5 s，60℃退火31 s，共40个循环。整个过程中收集荧光，反应结束后，使用Sequence Detection software version 1.2.3软件（Applied Biosystems公司）分析PCR过程各检测样本的Ct（Threshold cycle）值，Ct值随模板浓度增大而减少。由熔解曲线判断PCR反应的特异性。
2.3 统计方法 计量资料用±s表示，用SPSS13.0统计软件进行分析。多组间差异的显著性分析用单因素方差分析，组间两两比较用SNK检验。
3 结果
3.1 产物鉴定 实时定量PCR产物2%凝胶电泳图见图1。
图1 2%凝胶电泳图分析real time PCR扩增产物（略）
各产物的熔解曲线仅有1个峰，说明为单一片段扩增，熔解温度分别为GAPDH 86.9℃，CTGF84.8℃。扩增产物经2%琼脂糖电泳，紫外线下扫描分析，GAPDH为120～150bp，CTGF为180-200bp。符合设计的片断长度。
3.2 扩增效率分析〔5〕将一只大鼠肝脏组织的RNA反转录成cDNA并以2倍梯度稀释，相对浓度为1，0.5，0.25，0.125，以其为实时荧光定量PCR扩增模板，实验中每样本均做2个复孔。另加3个无模板的阴性对照，所有计算采用每个样本所得的平均循环数值，且样本复孔的Ct值之间差异小于1个循环。以GAPDH和CTGF的Ct值与对应的相对浓度对数值作图（图2），GAPDH和CTGF对应的直线相关系数R2分别为0.998 2和0.999 8，斜率分别为为-3.2791和-3.2525，扩增效率根据E=10(-1/alope)计算，EGAPDH为2.0182，ECTGF为2.0298。结果表明GAPDH和CTGF扩增效率一致，2-ΔΔCt相对定量方法适合于本试验。