大鼠实验性胃溃疡自愈期间肠嗜铬样细胞的变化(一)
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作者：何美蓉，张绍荣，宋于刚，陈学清
【关键词】 胃溃疡
Change in enterochromaffinlike cells during healing of experimental gastric ulcer in rats
【Abstract】 AIM: To investigate the morphologic and functional changes in enterochromaffinlike (ECL) cells during the healing of experimental gastric ulcer in rats. METHODS: Acetic acidinduced ulcers were caused by application of acetic acid to the serosal surface of the anterior face of the rat gastric bodies. At different time points during ulcer healing, ECL cells, histidine decarboxylase (HDC) mRNA expression and histamine content were studied using immunohistochemical staining, reverse transcriptionpolymerase chain reaction and radioimmunoassay, respectively. RESULTS: pared with that in control group, the percentage and the mean gray value of HDCpositive cells in gastric mucosa of ulcer rats decreased immediately on day 1, most markedly on day 6. They began to increase on day 9 and returned to the initial levels on day 12. The HDC mRNA expression in gastric mucosa of ulcer rats decreased on day 1, most markedly on day 6, subsequently rose gradually and almost normalized on day 9. The histamine content in gastric mucosa of ulcer rats also decreased, lowest on day 6 after ulcer induction. CONCLUSION: ECL cells maybe participate in the regulation of ulcer healing by weakening the function of histamine synthesis.
【Keywords】 gastric ulcer; enterochromaffinlike cell; histidine decarboxylase; histamine
【摘要】 目的：探讨肠嗜铬样细胞与大鼠实验性胃溃疡自愈的关系. 方法：通过制备大鼠乙酸性胃体溃疡模型，采用免疫组化、逆转录聚合酶链反应（RTPCR）和放射免疫测定的方法，观察溃疡自愈过程中大鼠胃黏膜内ECL细胞形态、组氨酸脱羧酶（HDC）mRNA和组胺含量的变化. 结果：胃溃疡大鼠胃黏膜内HDC阳性细胞率和胞质平均灰度值在制模术后第1日即开始降低，术后第6日达到最低，随后开始回升，术后第12日基本正常. 胃黏膜内HDC mRNA表达在制模术后第1日开始降低，第3日最明显，第6日开始恢复，第9日后接近正常. 制模术后胃黏膜内组胺含量也出现下调，以术后第6日为最低. 结论：ECL细胞可通过减弱其合成组胺的功能，参与胃溃疡自愈的调节过程.
【关键词】 胃溃疡；肠嗜铬样细胞；组氨酸脱羧酶；组胺
0引言
肠嗜铬样（enterochromaffinlike，ECL）细胞是组胺的主要来源细胞，而组胺是胃酸分泌的重要调节因子，采用H2受体拮抗剂阻断组胺H2受体几乎能完全抑制胃酸分泌〔1-3〕. 大鼠实验性胃溃疡自愈过程中，胃酸分泌自动下调，从而减弱对新生肉芽组织的消化作用，以促进溃疡的修复. ECL细胞在溃疡自愈过程中的变化规律目前尚不清楚. 我们对大鼠实验性胃溃疡自愈过程中，胃黏膜内组氨酸脱羧酶（histidine decarboxylase, HDC）蛋白和mRNA表达及组胺含量变化进行了动态观察如下.
1材料和方法
1.1材料
雄性8 wk龄Wistar大鼠36只，体质量200~250 g，其中假手术组6只作为对照组，胃溃疡组30只. 采用乙酸制备大鼠胃体溃疡模型. 制模前禁食24 h，不禁水. 30 g/L戊巴比妥钠1 mL/kg ip麻醉. 上腹部备皮，消毒，取剑突下1.5 cm纵切口暴露胃，纯乙酸25 μL滴于直径5 mm的滤纸上，作用于腺胃前壁浆膜面90 s，用生理盐水20 mL将乙酸冲洗干净，腹壁逐层间断缝合，术后单笼饲养，给予标准饮食和自来水〔4〕. 假手术组以生理盐水代替乙酸进行以上的所有造模过程. 假手术组处死于制模术后3 d，胃溃疡组处死于术后1，3，6，9和12 d，每次6只. 沿胃大弯剪开大鼠胃壁，PBS液冲洗干净后平铺，将溃疡边缘勾画在玻璃纸上，以便用每小方格1 mm×1 mm的坐标纸估算溃疡面积. 剪取溃疡旁约3 mm×5 mm的组织条，置于40 g/L多聚甲醛溶液中，拟做石蜡块，行HE和免疫组化染色. 剪取溃疡旁约60 mg 的胃黏膜，冻存于-80℃冰箱，一半用于RTPCR检测，另一半用于放射免疫测定.
1.2方法
1.2.1ECL细胞的免疫组化染色常规石蜡切片分别行HE和免疫组化染色. 采用免疫组化SABC法对ECL细胞进行染色（SP9000免疫组化染色试剂盒由北京中山生物技术有限公司生产)，HDC mAb(由武汉博士德生物工程有限公司生产）. HDC抗体稀释度为1∶50. 用MIPS医学图像分析系统在400放大倍数下，在每张切片的黏膜层内随机选取5个视野，分别统计HDC阳性和阴性细胞数，最后计算出阳性细胞百分率. 从每张切片中随机选取20个HDC阳性细胞，测定其阳性胞质灰度值，并计算平均灰度值，以反映阳性胞质单位面积内HDC的相对含量.
1.2.2RTPCR检测HDC mRNA表达采用Trizol（Invitrogen公司）提取胃黏膜标本的总RNA，以ReverrAidTM 第一链cDNA合成试剂盒（Fermentas公司）进行逆转录，PCR PreMix进行PCR反应. 扩增HDC的引物对为：正义：5＇ GACTGGCTGGCGAAGA 3＇，反义：5＇TCTGGCACAGATGG 3＇，预计扩增产物为437 bp，PCR反应条件为：95℃ 3 min，94℃ 45 s，53℃ 45 s，72℃ 1 min共32个循环，72℃ 7 min. 扩增内参βactin的引物对为：正义：5＇AACAAGATGTACG 3＇，反义：5＇ATGTCACGCACGATTTC 3＇，预计扩增产物为253 bp，与HDC同管扩增. PCR产物以含0.5 mg/L溴乙锭的20 g/L琼脂糖凝胶电泳分离，紫外光照下以计算机图像分析系统成像和定量分析〔5〕.