T细胞激活剂对Jurkat 细胞重组激活基因表达的影响(一)
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作者：邹红云，马骊，姚新生，温茜，王小宁
【关键词】 T细胞激活剂,；Jurkat细胞；重组激活基因；逆转录聚合酶链反应
【Abstract】 AIM: To investigate the effects of T cell activators on the mRNA expression of rebinationactivating genes (RAGs) in Jurkat cells. METHODS: After Jurkat cells were treated with PHA (20 mg/L), antiCD3 mAb (1∶100), PMA(40 μg/L)+A23187 (0.5 μmol/L) for 6 and 12 h respectively, RAG1 and RAG2 mRNA were measured by RTPCR. Semiquantitative analysis was used to eva luate RAG1 and RAG2 mRNA levels in different groups. RESULTS: pared with the control groups, the levels of RAG1 mRNA were significantly lower in different treated groups (P0.05), and RAG1 mRNA levels were associated with treatment time. RAG2 mRNA levels in PHA treated groups were significantly lower than those in the control groups (P0.05). No RAG2 mRNA was detected in PMA+A23187 treated groups. However, RAG2 mRNA level was significantly higher in antiCD3 mAb (12 h) treated group than that in control groups(P0.05). CONCLUSION： RAG1 and RAG2 mRNA were coexpressed in Jurkat cells and could be regulated by T cell activators. The results may give a clue that Jurkat cells maybe provide an ideal cell line model for studying the regulation of RAGs in peripheral T cells.
【Keywords】 T cell activators; Jurkat cells; rebinationactivating genes; reverse transcriptase polymerase chain reaction
【摘要】 目的： 研究T细胞激活剂PHA，抗CD3 mAb, PMA+A23187对人T细胞白血病细胞株Jurkat重组激活基因（RAGs ）mRNA表达水平的影响. 方法： 采用RTPCR法检测不同T细胞激活剂作用不同时间后Jurkat 细胞中RAG1, RAG2 mRNA，以β肌动蛋白（βactin）的表达作为内参照进行灰度分析，比较不同组Jurkat细胞RAGs mRNA的表达水平 . 结果： 三种T细胞激活剂刺激诱导的Jurkat细胞RAG1 mRNA表达量明显低于对照组（P0.05），且RAG1 mRNA表达量的下降与刺激诱导作用时间有关；PHA刺激诱导后RAG2表达量显著低于对照组（P0.05）；PMA+A23187刺激诱导6, 12 h均未检测出RAG2 mRNA的表达； 而抗CD3 mAb作用12 h组RAG2 mRNA表达量显著高于对照组（P0.05）. 结论： Jurkat细胞同时表达RAG1, RAG2 mRNA，并在一定诱导下RAGs表达量发生改变，因此有可能成为研究外周T细胞RAGs表达调节的一个潜在的细胞模型.
【关键词】 T细胞激活剂 ；Jurkat细胞；重组激活基因；逆转录聚合酶链反应
淋巴细胞特异性重组激活基因（rebination activating genes， RAG）1和RAG2是参与V(D)J重排和功能性抗原受体基因形成的一个首要条件〔1〕. 一般认为，RAG1, RAG2基因仅特异性地同时表达于淋巴细胞发育的早期阶段，而不表达于淋巴细胞分化发育的较成熟阶段. 然而，近年的研究发现，外周成熟淋巴细胞中也有RAGs表达和V(D)J重排的发生〔2-3〕. 迄今，外周淋巴细胞RAGs mRNA 的表达和调节机制仍不清楚. 本研究以代表T细胞发育成熟阶段的人T细胞白血病细胞株Jurkat细胞为研究对象，检测其RAG1和RAG2 mRNA的共表达情况，探讨T细胞激活剂对Jurkat 细胞RAGs mRNA表达水平的影响，为研究外周T细胞的RAGs表达调节机制奠定基础.
1材料和方法
1.1材料Jurkat细胞株购自上海细胞生物研究所（clone E61, AT Number TIB152, TCRαβ+CD3+CD4+CD8CD2+CD7+). 分泌抗CD3 mAb的杂交瘤细胞株12F6由南方医科大学分子免疫学研究所冻存. RPIM 1640培养基（美国GIBCO 公司）；胎牛血清（杭州四季青生物工程公司）；植物血凝素(Phytohemagglutinin, PHA 广东医药工业研究所产品）；佛波醇12豆蔻酰13乙酸酯（Phorbol 12Myristate 13Acetate，PMA），钙离子载体A23187（美国Sigma 公司）；总RNA提取试剂盒（安徽优晶生物工程有限公司）；RNA逆转录试剂盒（日本TOYOBO公司）；Taq DNA聚合酶（立陶宛MBI Fermentas 公司）；pUCmT 载体（上海生工生物工程技术服务有限公司）；DL2000 DNA Marker（TaKaRa大连宝生物有限公司）.
1.2方法
1.2.1细胞培养、处理及总RNA提取Jurkat细胞用含有100 mL/L胎牛血清的RPMI 1640培养基于37 ℃, 50 mL/L CO2条件下培养. 将对数生长期的Jurkat细胞，按1×109/L的密度培养于12孔板中，分别加入PHA（20 mg/L）,抗CD3 mAb（1∶100）, PMA（40 μg/L）+A23187（0.5 μmol/L），同时设不加任何处理因素的对照组，每组均设3个复孔，分别在培养的第6, 12 h ，收集各组细胞，PBS洗涤2~3次后采用试剂盒提取细胞总RNA，在核酸蛋白分析仪（BECKMAN DU530）上鉴定RNA纯度和浓度，-70℃冻存备用.
1.2.2RNA逆转录取样品总RNA约1 μg，加到20 μL反应体系中按试剂盒说明进行逆转录.
1.2.3PCR扩增RAG1, RAG2 mRNAPCR引物由上海博亚生物技术有限公司合成. RAG1上下游引物序列分别为：5＇GAGCAAGGTATCAGAG3＇， 5＇GAGGCATCTGAGAATGCAG 3＇，扩增片段长度为984 bp，PCR反应条件为94℃ 2 min；94℃ 30 s, 58℃ 45 s，72℃ 1 min，30个循环；RAG2上下游引物序列分别为：5＇ATATGGTTTAGCGGCAAA3＇, 5＇AGTTTTTGTAAAGAA 3＇， 扩增片段长度为192 bp，反应条件为94℃ 2 min；94℃ 15 s，60℃ 20 s，72℃ 45 s，30个循环； βactin 上下游引物序列分别为：5＇ACATTAAGGAGAAGCTGTGC3＇, 5＇CTCAGGAGGAGCAATGATCTTGAT3＇， 扩增片段长度375 bp. βactin与RAG1或RAG2在同一反应体系中扩增. PCR产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色后采用凝胶成像系统（BIORAD Gel Dox XR system）照相.
1.2.4PCR产物的克隆和序列分析切胶回收并纯化PCR目的产物条带，将之与pUCmT载体连接后转化DH5α感受态菌，采用α互补实验挑选阳性克隆进行测序，DNA序列测定由大连宝生物工程有限公司完成.
1.2.5RTPCR产物半定量分析将PCR产物电泳条带用全自动图像分析系统（德国KONTRON IBAS 2.0）分析，测出每一条带的面积（AREA）乘以平均光密度（mean optical density of the object, OPTDM），得出结合光密度（integrated optical density of the object, OPTDI)，根据RAG1和RAG2与βactin OPTDI的比值计算目的基因的相对表达量来进行半定量分析.