人脐静脉内皮细胞的体外分离培养及鉴定(一)

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作者：秦明春，王若光，秦莉花，刘小丽，李春梅，刘惠萍 ，叶赞

【摘要】 目的 探讨人脐静脉内皮细胞的原代培养方法，提高体外分离培养血管内皮细胞的成功率。建立血管内皮细胞培养模型，为体外研究血管内皮细胞提供实验基础。方法 取2根脐带（至少20 cm）冲净淤血，采用加工穿刺针固定脐静脉灌注消化液, 一根用0.2％胶原酶Ⅱ，另一根用0.1％胶原酶Ⅰ和0.25％胰酶等比混合消化液，比较两种酶的消化效果。收集细胞并用含有10 ng/mL的VEGF的培养基中培养，观察细胞的生长及传代。并在倒置显微镜下观察细胞的形态学特点，同时用免疫组织化学的方法对所得细胞进行鉴定。用流式细胞术观察细胞周期。结果 两种消化酶方法均获得了相当数量的人脐静脉内皮细胞，胶原酶Ⅱ的消化效果稍优于混合消化酶，且比较理想的消化时间均为13 min，细胞接种后4～5 h开始贴壁生长，1周左右可生长成单层，光镜下呈多角形，“铺路石”样排列，免疫组织化学法可见内皮细胞胞浆中人第Ⅷ因子相关抗原呈阳性反应。细胞周期显示约有50.6%的细胞处于G0/G1期。结论 胶原酶Ⅱ和胶原酶Ⅰ与胰酶等比混合消化液灌注法是获得脐静脉内皮细胞的一种可取方法，而胶原酶是分离培养脐静脉内皮细胞的首选消化液，成功率高，可靠性大，可成功构建体外研究血管内皮细胞的模型。

【关键词】 人脐静脉内皮细胞；细胞培养；流式细胞术；细胞周期；分离；鉴定

Cultivation and in vitro identification of endothelial cells from human umbilical vein

〔Ａｂｓｔｒａｃｔ〕 Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ To explore the primary culture method of human vascular endothelial cells(ECs) from umbilical vein, enhance the suess rate of separating and culturing ECs in vitro, establish the model of human vascular ECs, and provide an experimental method for research of ECs. Methods The umbilical veins in human umbilical cords, 20 cm long, were fixed and filled the digestive fluids, 0.2% collagenenaseⅡ in one cord and the plex enzyme of 0.25% trypsin and 0.1% collagenaseⅠin an other, and the digestive results were pared. All the cells were collected and cultured in fluid with 10 mg/mL VEGF, their procreation and generation were observed, the morphologic characteristics of ECs were observed with light microscopy and immunohistochemistry under inverted microscope, and the cell cycle was observed by flow cytometer. Results Enough ECs were obtained from both digestive liquids, and collagenenaseⅡ was better than plex enzyme, the effective digesting time was 13 minutes. the culturing cells grew on the wall appeared after 4-5 hours and the monolayer cells were formed after one week. Ⅷ factor in the ECs showed positive reaction by immunohistochemistry. Cell cycle revealed that 50.6% cells were at stage of G0/G1. Conclusion The perfusion with colla 〔Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓ〕 human vascular endothelial cell in umbilical vein; cell culture; flow cytometry; cell cycle; separation; identification

血管内皮细胞是位于血管内壁的单层细胞，通过产生和分泌许多血管活性物质，在维持血管舒缩、抗凝血及血管构建等方面起重要作用，同时由于其特殊的解剖学部位使内皮细胞能敏感地感知血流、压力、炎症信号以及血液循环中激素水平的变化，通过一系列的信号转导过程与邻近及远处的细胞相互联系，对各种刺激作出反应，维持机体内外环境的稳定。内皮细胞的体外培养是研究内皮细胞生物学与多种疾病关系的重要方法。新生儿脐带由于取材方便，来源充足，而成为血管内皮细胞体外实验的主要材料。本文利用健康产妇正常娩出的胎盘端游离脐带，采用改进的灌注消化法，运用不同的消化酶成功分离了人脐静脉内皮细胞，并用免疫组织化学法进行了鉴定，从而为构建体外研究血管内皮细胞的模型及进一步实验研究打下了基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 标本来源与采集 标本均来自于湖南中医药大学第一附属医院妇产科正常足月妊娠娩出的新生儿脐带。于无菌条件下剪下脐带（至少20 cm）放入装有培养基的无菌容器中，快速移入实验室，1 h内行脐静脉内皮细胞的分离培养。

1.1.2 试剂 PRMI-1640培养基、类标准胎牛血清（Hyclone)；L-谷氨酰胺（Sigma公司）；VEGF（Sigma公司）；胰蛋白酶（Amresco公司）；胶原酶Ⅰ、Ⅱ（Gibco公司）；兔抗人Ⅷ因子相关抗原免疫组织化学检测试剂盒(北京中杉金桥生物技术有限公司)；青-链霉素（Gibco公司）；其它试剂均为国产分析纯。

1.1.3 仪器 水套式CO2培养箱（2300型，SHEL-LAB）；超净工作台（SW-CJ-IF，苏州安泰空气技术公司）；台式多管自动平衡离心机（TDZ5-WS，长沙平凡仪器仪表有限公司）；倒置显微镜（XD-101型，南京江南光电股份有限公司）；制冰机（AF100型，斯科茨曼公司）；超纯水仪（Maxima Scientific，ELGA公司）；电热重蒸水器（ZLSC，上海申安医疗器械厂）；座式自控电热压力蒸气灭菌器(ZDX-35型，上海申安医疗器械厂)；电子分析天平（AB204N型，梅特勒－托力多有限公司）；流式细胞仪（BECTON Dickinson）。

1.2 方法

1.2.1 人脐静脉内皮细胞的原代分离及培养 将取来的脐带迅速移入洁净操作台内，无菌条件下将其放入提前盛有预热PBS培养皿中，剪去有钳夹痕及血肿的部分，挤出脐带中的血，用剪刀修齐两断面，分成20 cm的一段。找出脐静脉（2根管腔较细的是脐动脉，1根管腔较粗的是脐静脉），用带平针头的注射器从一端插入脐静脉，血管钳固定，再用预热的PBS冲洗3次以上，将血迹完全冲洗干净。为防止脐动脉残留的血液混入，可将动脉分离少许用消毒线结扎，用止血钳钳夹另一端。从冲洗的针头中注入0.1%胶原酶Ⅱ使其充盈，另一条以同样的方法注入0.1%胶原酶Ⅰ和0.25%胰酶等比混合消化液。取出针头，用止血钳夹住注入端，移入无菌烧杯中，置于37 ℃培养箱中孵育13 min。取出，松开注入端的血管钳，收集脐静脉内的消化液，然后注入含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液再次冲洗管腔，将消化液与冲洗液一并收集于离心管，1 000 r/min，离心5 min，弃上清，加入RPMI-1640完全培养液（含20%胎牛血清，10 ng/mL VEGF。L-谷氨酰胺2 mmoL/L,青霉素100 U/mL,链霉素100 mg/mL）,用巴氏吸管轻轻吹打均匀，按1×106个接种于培养瓶，置于5% CO2，37 ℃培养箱中培养，24 h后更换培养液去除未贴壁的细胞，然后每隔24 h半定量换液1次至细胞生长铺满瓶底。

1.2.2 人脐静脉内皮细胞的传代培养 待细胞生长融合成单层细胞后，弃去培养液，加入0.125%胰蛋白酶/0.02% EDTA混合消化液2～3 mL，倒置显微镜下观察，当细胞回缩变圆后弃去消化液，加入RPMI-1640完全培养液5～10 mL终止消化，用巴氏吸管吹打制成细胞悬液，按1∶2或1∶3比例将细胞悬液接种于培养瓶中，置于培养箱中培养。

1.2.3 人脐静脉内皮细胞的形态学观察及鉴定 细胞换液后直接在倒置显微镜下观察细胞的形态及生长特征，并作相差摄影，同时进行常规HE染色观察并摄片。鉴定采用DAB免疫组织化学法，在6孔培养板中放置载玻片，玻片上植入2 mL含有1×106的细胞悬液，待细胞贴壁后，取出载玻片，放入-20 ℃的冷丙酮中固定30 min,用PBS冲洗3次，每次2 min,滴加3% H2O2室温孵育10 min，PBS冲洗3次，每次2 min,以消除内源性过氧化物酶的活性。滴加兔抗人Ⅷ因子相关抗原多抗工作液，放入湿盒内4 ℃过夜，同时另一盖玻片不加一抗作阴性对照。次日，用PBS冲洗3次，每次2 min,滴加辣根酶标记的羊抗兔IgG, 37 ℃孵育30 min, PBS冲洗3次，每次2 min，用DAB底物混合工作液显色，显微镜下观察，待出现特异性染色后，终止显色，进行复染，脱水，透明，封片，相差显微镜下观察摄影。