外源核苷酸对受损小鼠胸腺细胞DNA修复的影响(一)
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【关键词】 核苷酸；DNA损伤;,DNA修复；,彗星试验
Effect of exogenous nucleotides on repair of damaged DNA in mouse thymocytes
【Abstract】 AIM: To investigate the effect of exogenous nucleotides on the repair of damaged DNA in mouse thymocytes in vitro. METHODS: Thymocytes from Kunming male mice were treated with NmethylN＇nitroNnitrosoguanidine (MNNG, 10 μmol/L) to induce DNA damage. DNAdamaged cells were cultured in basic or plete RPMI 1640 medium supplemented with different levels of nucleotides (0, 0.1, 1, 10 mmol/L). DNA damage and repair were analyzed at 2, 5 h with singlecell gel electrophoresis. RESULTS: Nucleotides had no significant effect on the percentage of et cells at 2 h in basic medium (P>0.05), but the percentage of et cells decreased significantly in plete medium with nucleotides supplementation (P0.01). The nucleotides supplementation significantly decreased the percentage of et cells at 5 h (P0.01). et tail length had no significant difference among groups at 2 h in basic or plete medium (P>0.05). Nucleotides of 1, 10 mmol/L decreased et tail length at 5 h in basic medium (P0.01) . The supplementation of 1, 10 mmol/L nucleotides decreased et tail length at 5 h in plete medium (P0.01). The percentage of DNArepaired cells was increased significantly with nucleotides supplementation between 2 and 5 h in basic (P0.05) or plete medium (P0.01). CONCLUSION: The supplementation of nucleotides can aelerate the repair of damaged DNA in mouse thymocytes in vitro. The effect of nucleotides is related with the supplemental levels of nucleotides.
【Keywords】 nucleotides; DNA damage; DNA repair; et assay
【摘要】 目的： 探讨外源核苷酸对受损小鼠胸腺细胞DNA修复的影响. 方法： 采用10 μmol/L的N甲基N硝基N亚硝基胍（MNNG）诱导小鼠胸腺细胞DNA损伤后，在终浓度分别为0，0.1，1和10 mmol/L核苷酸的RPMI1640基础培养基或完全培养基中培养，在培养的第2，5 h采用单细胞凝胶电泳技术分析细胞DNA损伤和修复情况. 结果： 培养2 h时，基础培养基中各组间的拖尾细胞百分率差异无统计学意义（P>0.05）；完全培养基中核苷酸能降低拖尾率（P0.01）. 5 h时，随着核苷酸添加浓度的升高，拖尾率均降低（P0.01）. 在相同的培养基中，各组的彗星尾长在2 h差异无统计学意义（P＞0.05），5 h后，在基础培养基中添加1，10 mmol/L的核苷酸使得彗星尾长降低（P0.05）；在完全培养基中添加1， 10 mmol/L的核苷酸也使得彗星尾长降低（P0.01）. 在培养的2～5 h内，补充核苷酸均能提高基础培养基（P0.05）和完全培养基（P0.01）中DNA修复细胞的百分率. 结论： 外源核苷酸能明显促进受损小鼠胸腺细胞DNA的修复，且核苷酸的作用与其添加水平有关.
【关键词】 核苷酸；DNA损伤;DNA修复；彗星试验
0 引言
核苷酸作为条件必需营养素，在维持和提高机体免疫功能方面发挥重要作用〔1〕. 有研究表明核苷酸（nucleotides, NTS）对免疫细胞DNA具有保护作用，能够减轻毒物、高脂等引起的细胞DNA损伤〔2-3〕. 我们在先前的实验中也观察到核苷酸能够减轻烷化剂对小鼠胸腺细胞DNA的损伤程度〔4〕，但有关核苷酸对DNA损伤后的修复有无作用的研究报道较少. 本试验拟在体外采用烷化剂N甲基N硝基N亚硝基胍（NmethylN＇nitroNnitrosoguanidine, MNNG）诱导小鼠胸腺细胞DNA损伤，旨在进一步探讨不同浓度的NTS对损伤后细胞DNA修复的影响.
1 材料和方法
1.1材料
健康清洁级昆明种雄性小鼠6只，5周龄，体质量20 g（第二军医大学实验动物中心）； MNNG（瑞士Fluka公司）；RPMI1640培养基（美国GIBCO公司）；胎牛血清（中科院上海生化所）；HEPES，谷氨酰胺（美国Amersco公司）；淋巴细胞分离液（上海华精生物高科技有限公司）；台盼蓝，5＇AMP,5＇CMP,5＇GMP,5＇UMP，5＇TMP（美国Sigma公司），其他试剂均为国产分析纯.
1.2方法
1.2.1细胞分离与处理
无菌条件下分离胸腺细胞，调节细胞悬液浓度为2×106个/mL. 将细胞分成2份，分别加入终浓度为0，10 μmol/L的MNNG，在37℃ CO2培养箱中作用0.5 h诱导细胞DNA损伤；离心去上清，用无菌PBS洗涤2次.
将不同浓度MNNG处理过的细胞再各分成2个处理组，其中A处理组加入RPMI1640基础培养基; B处理组加入完全培养基（基础培养基 + 10 g/L谷氨酰胺 + 100 mL/L 胎牛血清）培养. 每个处理组又均分成5组，分别加入终浓度为0，0.1，1，10 mmol/L的NTS. NTS组成：5＇AMP∶5＇CMP∶5＇GMP∶5＇TMP∶5＇UMP = 3∶2∶2∶1.5∶1.5，采用RPMI1640基础培养基配制，调pH=7.2，-20℃保存. 于37℃，50 mL/L CO2培养箱中培养,每个样品做5个重复. 在培养的第2，5 h选取细胞，按文献〔5〕的彗星电泳技术方法并稍作改动，分析细胞DNA损伤修复情况.
1.2.2彗星电泳
取100 μL 7 g/L正常熔点的琼脂糖凝胶铺在磨砂的载玻片上，作为低层胶；取10 μL细胞悬液与70 μL 7 g/L低熔点琼脂糖凝胶在37℃下混匀后铺在低层胶上，4℃凝固10 min；取85 μL 7 g/L低熔点琼脂糖凝胶铺第三层胶，4℃凝固10 min. 载玻片在4℃新鲜制备的细胞裂解液（2.5 mol/L NaCl, 100 mmol/L Na2EDTA, 10 mmol/L TrisHCl pH=10, 10 g/L肌氨酸钠）用前加入10 mL/L TritonX，100 mL/L DMSO中裂解1 h，然后在4℃电泳液中（1 mmol/L Na2EDTA, 300 mmol/L NaOH）解旋20 min，最后在25 V，300 mA条件下电泳30 min.
电泳结束后，用蒸馏水冲洗载玻片，25 μL 2 μg/mL的EB水溶液染色，在Olympus落射式荧光显微镜下观察载玻片. 每张片子观察100个细胞，计算拖尾细胞的百分率；用镜中标尺直接测量30个拖尾细胞的彗星总长和彗星头部直径,二者差值即为彗星尾长，取平均值作为该样品细胞DNA尾长. 按下列公式计算2～5 h 内DNA修复细胞百分率.
DNA修复细胞百分率(%)=(2 h拖尾细胞-5 h拖尾细胞)/2 h拖尾细胞×100%.