α-甲酰辅酶A消旋酶、核基质蛋白在前列腺癌早期诊断敏感性的比较(一)

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作者：刘志明，李泽惠，李志鹏

【摘要】 目的 检测前列腺癌和非前列腺癌患者前列腺液中α-甲酰辅酶A消旋酶（AMACR）、核基质蛋白（NMP）的含量，分析比较各指标对早期诊断的特异性和敏感性。方法 64例前列腺癌标本（年龄在50岁以上）和24例对照组标本均来自泌尿外科住院患者和门诊患者。用前列腺按摩的方法获取前列腺癌患者前列腺液64例，非前列腺癌患者共24例作为对照组。标本放于-70 ℃冰箱保存，在同一时间内用双抗体夹心酶联免疫反应（ELISA）检测标本。结果 α-甲酰辅酶A消旋酶在64例前列腺癌患者的前列腺液里有很高敏感性，敏感性为96.9%（62/64），而且是非前列腺癌患者的20倍以上，具有显著统计学意义（P＜0.01），仅有2例α-甲酰辅酶A消旋酶浓度和对照组没有区别（P＞0.05）,64例前列腺癌患者的核基质蛋白是对照组的4倍，敏感性为92.2%。结论 AMACR具有很高的敏感性和特异性，比NMP具有更高的敏感性和特异性。

【关键词】 前列腺癌；诊断；α-甲酰辅酶A消旋酶；核基质蛋白

〔Abstract〕 Objective To detect α-methylacyl-CoA racemase（AMACR），nuclear matrix protein（NMP）of prostate cancer and non-prostate cancer in prostatic fluid.To analyze and pare various indicators on early diagnosis specific and sensitivities.Methods 64 example of prostate cancer specimen（aged over 50 years old）and 24 example of control group specimen came from urology in-patient and the outpatients.With method of prostate massage to get the prostatic fluid of prostate cancer patients of 64 cases,non-prostate cancer patients were with a total of 24 patients as a control group,specimens.Placed in-70 ℃ refrigerator,at the same time using enzyme-linked immune response（ELISA）to test specimens.Results α-methylacyl coenzyme A racemase in 64 cases of prostate cancer in prostate fluid had a high sensitivity，and the sensitivity was 96.9%（62/64）,20 times higher than non-prostate cancer with significant significance（P0.01）.Only two cases of α-methylacyl coenzyme A racemase levels in the control group had no difference（P>0.05）.64 cases with prostate cancer of the prostatic nuclear matrix proteins level closed to 4 times higher than the control group,the sensitivity was 92%.Conclusion α-methylacyl-CoA racemase（AMACR）has a higher degree of sensitivity and specificity,than nuclear matrix protein（NMP）.

〔Key words〕 prostate cancer;diagnosis;α-methylacyl-CoA racemase;nuclear matrix protein

为检测前列腺癌和非前列腺癌患者前列腺液中α-甲酰辅酶A消旋酶（α-methylacyl-coenzyme A racemase,AMACR）、核基质蛋白（nuclear matrix protein,NMP）的含量，我们对64例前列腺癌标本和24例非前列腺癌标本进行对比研究，现将结果总结如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 64例前列腺癌标本（实验组）和24例非前列腺癌标本（对照组）来自我院泌尿外科住院患者和门诊患者。

1.2 主要的设备和试剂盒 温箱，酶标仪，自动洗板机，-70 ℃冰箱，可调微量移液器，离心机。试剂盒：鼠抗人α-甲酰辅酶A消旋酶、鼠抗人核基质蛋白，均购买于ADL公司。

1.3 实验步骤 （1）取出酶标板，依照次序分别加入100 μl标准品于空白微孔中。（2）分别标记样品编号，加入100 μl样品于空白微孔中。（3）在标准品孔和样品孔中加入50 μl的酶标记液，轻微震荡15 s。（4）（36±2）℃孵育反应60 min。（5）洗涤液用蒸馏水稀释20倍，洗板机清洗5次，每次均用吸水纸拍干，每次静置10～20 s。（6）每孔加入呈色剂A、B各50 μl,轻微震荡5 s。（7）（36±2）℃下避光孵育反应15 min。（8）每孔加入50 μl终止液,终止反应。（9）轻微混匀30 s,使蓝色充分变成黄色。（10）在30 min内放于波长450 nm酶标仪上读取各孔的OD值。（11）以标准品OD值为纵坐标,以标准品的浓度为横坐标,绘制标准曲线。（12）根据样品的OD值查找对应的浓度范围。

2 结果

　　见图1～10，表1。

我们的研究结果显示64例前列腺癌患者α-甲酰辅酶A消旋酶有62例表达强阳性，敏感性达96.9%（62/64），2例和正常对照组没有区别（P＞0.05），24例对照组无一例显示AMACR浓度达到实验组的平均值，假阴性率为2%，对照组浓度范围在1～5 ng/ml。实验组的平均浓度是对照组平均浓度的近20倍。核基质蛋白的含量在64例患者中有59例超过正常的近8倍，实验组的平均浓度是对照组平均浓度的4倍多，但是前列腺癌的核基质蛋白平均浓度为35.52 ng/ml,这和资料显示的超过35.5 ng/ml相近。敏感性高达92.2%（59/64），但是仍然有7.8%（5/64）的假阴性，12.5%（3/24）的假阳性。

　　3 讨论

3.1 AMACR在前列腺癌患者的前列腺液里表达的分析 AMACP是最近通过大规模cDNA组织微阵技术发现的一种前列腺癌特异性标记物。

3.1.1 AMACR生化特点 AMACR广泛表达于正常人体的肝、肾、骨骼肌、纤维组织、胆囊和大脑,在肠道也有中等表达〔1〕。它位于细胞的过氧化物酶体和线粒体中,主要参与支链脂肪酸及其衍生物和胆汁酸的β氧化代谢。它使化合物从R结构转化为S异构体,只有这样化合物才能继续被β氧化〔2,3〕。AMACR缺乏会导致植烷酸、降植烷酸的聚集。

3.1.2 AMACR基因特征 AMACR基因位于5p13,与前列腺癌易感基因位于同一区域。Zheng等〔4〕对前列腺癌家族研究AMACR易感性和基因多态性后，认为M9V和D175的单倍型与前列腺癌有强相关性。Mubiru等〔5〕发现人体存在5种AMACR mRNA（ⅠA、ⅠB、ⅡA、ⅡB、ⅡAs）,只有AMACRⅠA在C末端有1型过氧化物酶体目的信号（PTS1）,因此是过氧化物酶体内唯一的mRNA;5种mRNA在N端都有线粒体目的信号（MTS）。Shen等〔6〕 发现ⅡA与富马酸水合酶具有广泛同源性。ⅠA在前列腺癌中高表达,ⅠB、ⅡA、ⅡB广泛存在于正常前列腺、前列腺肿瘤、PC-3和肝脏中。ⅠA、ⅡA在前列腺肿瘤组织比正常前列腺组织表达明显增高约40～45倍,而其他mRNA表达无明显改变。

3.1.3 AMACR在前列腺癌中的表达 AMACR高表达于前列腺癌、结直肠癌、乳腺癌〔7〕和乳头状肾细胞癌〔8〕，以前列腺癌表达最高,其在前列腺癌细胞过氧化物酶体和线粒体中的活性也明显增强〔9〕。AMACR在某些特殊类型的前列腺癌如假性增生性前列腺癌、激素治疗后和放疗后前列腺癌也有明显表达〔10，11〕,而在正常前列腺、良性前列腺增生、癌旁组织、非典型性瘤样增生（AAH）、各种前列腺良性改变如萎缩、萎缩后增生（PAH）、基底细胞增生（BCH）和正常精囊等均无表达或微弱表达〔12,13〕。Arun等〔14〕用ELISA法从前列腺癌患者血液中检测AMACR，发现敏感性和特异性都高于用PSA检测前列腺癌，分别为77.8%和80.6%，45.6%和50%,此结果是PSA在4～10 ng/ml的前列腺癌，AMACR有可能取代PSA在4～10 ng/ml的前列腺癌的检测；Carswell等〔15〕用793个病理标本中的84个病例用以前传统的HE染色诊断为阴性的标本，用AMACR方法诊断为阳性，Carswell等还发现在前列腺穿刺标本中有1%假阴性，有以下几个方面导致穿刺标本的假阴性。（1）有限的一些癌腺体，往往只有少数几个腺泡可用于组织病理学评价。（2）没有一个单一具体的特征来专门和充分地诊断前列腺癌。诊断是基于结构和细胞学特征的相结合和染色（如蓝色）等。（3）假阳性诊断造成的后果是相当严重的，如不必要的前列腺切除，或假阴性的诊断延迟有效的治疗。虽然1%假阴性率不是很高。但是对于那些没有用穿刺诊断为前列腺癌的患者是很重要的,尤其是Gleason分级是8的前列腺癌的患者〔16～19〕，这就需要一个更高的敏感性和特异性标记物来检测。AMACR被证实诊断前列腺癌具有更高的敏感性,敏感性在80%～100%,尤其是对于比较小的局灶性前列腺癌〔20～22〕。盛璐等〔23〕用前列腺癌（PCa）标本46例,良性前列腺增生（BPH）53例,前列腺上皮内瘤（PIN）13例,正常前列腺9例,前列腺炎6例,膀胱癌转移前列腺3例,前列腺间质肉瘤、鳞癌、未分化癌各1例。平均年龄71岁。采用HE染色及P504s的兔单克隆抗体行免疫组化分析。P504s表达分为阴性（1分）、弱阳性（2分）、阳性（3分）、强阳性（4分）。结果46例PCa标本中P504s阴性2例、弱阳性1例、阳性25例、强阳性18例,53例BPH标本中P504s阴性47例、弱阳性6例,13例PIN标本中P504s阴性12例、弱阳性1例,PCa组与BPH、PIN组差异有统计学意义（P0.001）。正常前列腺、前列腺炎、前列腺间质肉瘤、鳞癌、未分化癌、膀胱癌转移前列腺标本P504s染色均为阴性。梁颜笑等〔24〕用EnVision二步法免疫组化检测并观察P504s在151例前列腺肿瘤中的表达,并结合HE病理诊断、前列腺特异抗原及临床资料进行分析。结果:151例前列腺肿瘤标本均呈AMACR强阳性（+++）。22例PCa中,21例P504s呈不同程度阳性;127例BPH中,仅1例可观察到P504s弱阳性;2例不典型小腺泡增生（ASAP），P504s均为阴性，P504s诊断前列腺腺癌具有较强的敏感性（95.5%）和特异性（99.2%）。甘为民等〔25〕用前列腺按摩的方法取前列腺液进行Papanicolaou染色和进行脱落细胞学分级，结果发现脱落细胞检查具有100%的特异性，在PSA≥20 μg/L的患者中，敏感性是42.86%。我们的研究结果发现64例前列腺癌患者有62例表达强阳性，敏感性达96.9%（62/64），2例和正常对照组没有区别（P＞0.05），24例对照组没有发现一例AMACR浓度达到实验组的平均值，假阴性率为2%，对照组浓度范围在1～5 ng/ml。实验组的平均浓度是对照组平均浓度的近20倍。

3.2 核基质蛋白与前列腺癌诊断 NMP是指间期细胞核经非离子去垢剂、高盐抽提及核酸酶消化等处理,依次去除胞核脂质、可溶性组蛋白及染色质后的残余亚核结构;其包括核孔复合体、核衬层、内纤维颗粒及残余核仁;主要由非组蛋白、少量DNA、RNA和脂质等组成。核基质对染色质组成、DNA复制、转录及基因表达等具有重要调控作用。NMP具有组织细胞特异性及肿瘤相关性。细胞癌变过程中NMP发生剧烈形态和生化变化,NMP变化必将导致DNA拓扑结构及基因与核基质相互作用的改变,也必将引起癌变过程中一系列连锁反应。研究发现,正常大鼠前列腺组织和R3227前列腺癌培养细胞NMP双向电泳图谱明显不同,其中10个蛋白点仅存在于正常组织中,3株前列腺癌培养细胞（G、AT-2、MLL）均缺失;同时又有3个蛋白点仅表达于上述3株前列腺癌细胞中,正常组织则未见表达。另外,各株细胞系间其NMP也不尽相同,非浸润性、非转移性细胞株G发现两种相关蛋白,而转移性细胞株AT-2和MLL也存在2种特异蛋白。人前列腺正常组织、增生组织及癌组织NMP双向电泳分析发现,3种组织间存在14种NMP差异表达,其中分子量为56 kD的PC-1特异存在于癌组织中,前两者组织则未见表达〔26〕,不同病理分期的人前列腺癌组织NMP也具有差异性表达,其中YL-1（76 kD）特异性存在于所有预后差的组织中,10例预后好的组织仅有3例表达,中间组10例有9例弱阳性表达,正常前列腺组织则无表达,表明该蛋白和前列腺癌恶性程度高度相关〔27〕。Naoto等〔28〕用309个镜下血尿的患者检测NMP，其中尿路上皮癌和前列腺癌患者的阳性率分别为90.9%和100%，NMP值高于35.5 ng/ml。许克新等〔29〕用标准ELISA法检测前列腺癌患者和非前列腺癌患者的尿液的NMP含量，结果发现阳性率为93.0%，Eddy等〔30〕于转基因模型老鼠前列腺癌里面成功分离出NMP,含量是非前列腺癌的20倍。核基质蛋白的含量实验组的平均浓度是对照组平均浓度的4倍多，和Eddy等〔30〕于转基因模型老鼠前列腺癌里面成功分离出NMP文献报道的不一样，敏感性高达92%（59/64）；和许克新等〔29〕用标准ELISA法检测前列腺癌患者和非前列腺癌患者的尿液的NMP含量阳性率为93.0%相近；和Naoto等〔28〕用309个镜下血尿的患者检测NMP，其中尿路上皮癌和前列腺癌患者的阳性率分别为90.9%和100%相近，但是仍然有7.8%的假阴性，12.5%的假阳性，前列腺癌的核基质蛋白平均浓度为35.52 ng/ml,这和资料显示的超过35.5 ng/ml相近。从上面的分析可以看出AMACR具有更高的敏感性和最低的假阳性及最低的假阴性。