X5型大孔树脂分离纯化夏枯草中两种五环三萜酸(一)

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【摘要】 　　目的研究从夏枯草提取液中分离纯化齐墩果酸和熊果酸的工艺。方法夏枯草乙醇提取液经溶剂萃取和酸碱沉淀后，再用大孔吸附树脂进一步富集纯化两种五环三萜酸。结果X-5型大孔树脂富集纯化齐墩果酸和熊果酸的最优条件为：采用两者总浓度为1.324 g/L的夏枯草样品液上柱，调节pH=7左右，室温下以流速1.0 BV/h吸附饱和；解吸时先用水淋洗，再用30%，50%，70%，90%(V/V)(pH=11)乙醇解吸，流速1.0 BV/h，收集90%乙醇洗脱液，所得产品中两者总含量达到87.30%，收率为81.30%。 结论该工艺简单可行，产品中目标组分纯度和收率较高，易实现工业化。

【关键词】 大孔树脂 夏枯草 齐墩果酸 熊果酸 分离纯化

夏枯草Prunella vulgaris L.是唇形科植物夏枯草的干燥果穗，具有降压、抗炎、抑制免疫、抗菌和降血糖等作用〔1〕，其中两种主要五环三萜类成分齐墩果酸和熊果酸已被证实具有抗癌、消炎和抗病毒等作用〔2，3〕。硅胶柱层析是最常用的分离纯化三萜类成分的技术，但其工艺流程较长，硅胶不易于再生，工业化成本高。近年来，大孔吸附树脂技术以其独特的优势广泛用于中草药中水溶性物质的分离，如水溶性生物碱、黄酮类、苷类、皂苷类、多酚类或酸性化合物、糖类、维生素、色素等〔4，5〕。大孔吸附树脂分离脂溶性成分，特别是三萜皂苷元的研究很少〔6，7〕。本文尝试筛选大孔吸附树脂对夏枯草中两种五环三萜酸进行富集纯化，以期对中药夏枯草产品的开发和拓展齐墩果酸及熊果酸的药源贡献一点微薄之力。

　　1 器材与方法

　　1.1 仪器和试剂

　　夏枯草为市售药材，经鉴定为Prunella vulgaris L.的干燥果穗；齐墩果酸(Oleanolic acid,OA)和熊果酸(Ursolic acid,UA)对照品(HPLC纯度≥98%)购自中国药品生物制品检定所；D4020，S-8，X-5，AB-8，NKA-9，D3520，D4006，NKA-II型大孔吸附树脂购自南开大学化工厂；其它试剂均为分析纯，实验用水为二次蒸馏水。
PHS-3C型精密酸度计（上海雷磁仪器厂）；岛津LC-2010A高效液相色谱仪，配有二极管阵列检测器VP SPD-M10A，Hedera ODS-2色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)。

　　1.2 大孔吸附树脂的预处理树脂先用无水乙醇浸泡24 h，待充分溶胀后用无水乙醇在提取器内提取8h，以除去树脂中所含杂质。湿法装柱至柱高2/3处，依次用下列溶液冲洗：95%(V/V)乙醇以流速2BV/h洗至流出液澄清；水以2 BV/h的流速洗尽乙醇，φ(HCl)=5%的水溶液以流速4～6 BV/h进行淋洗，并浸泡2～4 h，水洗至中性；w (NaOH)=2%的水溶液以流速4～6 BV/h进行碱洗，水洗至中性，即处理完毕。

　　1.3 样品制备及测定方法

　　1.3.1 夏枯草样品制备

　　将夏枯草在烘箱中60℃下干燥24 h，粉碎过40目筛。称量大约2.0 kg粉末，加入10 L 95%(V/V)乙醇80℃下回流两次，2 h/次，得深绿色浸膏。加适量水制成悬浮液后经石油醚、氯仿、正丁醇萃取。将氯仿萃取部分浓缩蒸干，无水乙醇溶解后，用5%NaOH调节溶液pH=11，所得滤液用10%HCl酸化至pH=3，再加入1倍量pH=3的蒸馏水，过滤所得沉淀用蒸馏水洗至中性，60℃真空干燥，得到包含OA和UA在内的三萜酸富集物，用pH=7的75%(V/V)乙醇溶液配制成两者总量为2.137 g/L的夏枯草样品液。

　　1.3.2 夏枯草样品中三萜酸含量测定

　　采用反相高效液相色谱法测定OA和UA的含量，以保留时间定性，外标法定量。色谱条件如下：流动相为甲醇-水-冰醋酸（90∶10∶0.3，V/V/V)；流速1.0 ml/min；检测波长λ=210 nm；进样量10 μl；柱温30℃。实验发现OA和UA进样量分别在0.36～3.6 μg和0.78～7.8 μg时，进样量(m/μg)和峰面积(s/μV・s)呈良好的线性关系。熊果酸的回归方程式为s=187 023+3.066 36×106 m,r=0.999 91；齐墩果酸的回归方程式为s=7 341.52+2.563 81×106 m，r=0.999 95。

　　1.4 大孔吸附树脂筛选选择D4020，S-8，X-5，AB-8等8种大孔吸附树脂进行实验，测定这8种树脂对夏枯草中两种五环三萜酸的静态吸附量和解吸率以筛选树脂。取1.0 g预处理好的大孔吸附树脂于带塞的磨口锥形瓶中，加入OA和UA总浓度为2.137 g/L的夏枯草样品液40.00 ml，于室温下振荡（180 r/min）24 h至吸附平衡，测定滤液中两者含量，按式(1)计算各树脂的静态吸附量。用pH=11的90%(V/V)乙醇溶液40.00 ml对吸附饱和的树脂进行解吸，测定解吸液中两者的含量，按式(2)式计算解吸率。

　　吸附量（mg/g）-（Co-Ce）×Vm式(1)

　　解吸率（%）=V1c1(co-ce)V×100%式(2)

　　其中co起始浓度，ce平衡浓度，V吸附液体积，m树脂质量，c1为解吸液浓度，V1为解吸液体积。

　　1.5 静态吸附实验准确称取已预处理的树脂1.0 g于具塞的磨口锥形瓶中，加入OA和UA总浓度为2.137 g/L的夏枯草样品液40.00 ml，室温下振荡（180 r/min）24 h至吸附平衡。定时取样进行分析，计算吸附量，绘制静态吸附动力学曲线。

　　准确称取已预处理的树脂1.0 g于具塞的磨口锥形瓶中，加入不同浓度的夏枯草样品液40.00 ml，室温下振荡（180 r/min）24 h至吸附平衡，测定吸附平衡时夏枯草提取液中OA和UA的浓度，计算吸附量，绘制静态吸附等温线，并用Langmuir等温吸附方程式对实验结果进行拟合。

　　1.6 动态吸附容量的测定将夏枯草样品液通过已预处理的装有1.0 g树脂的层析柱，进行动态吸附，分段收集流出液，测定收集液中OA和UA的含量，考察泄露曲线，确定样品液的最大上柱体积。

　　1.7 动态吸附和动态解吸实验将10 g已预处理的树脂湿法装入2 cm×50 cm层析柱中，将夏枯草样品液以一定的流速通过色谱柱，测定流出液中OA和UA的含量，考察上柱液pH值、浓度、流速等因素对树脂吸附性能的影响，确定最佳的吸附工艺条件。对已吸附样品的树脂用乙醇溶液进行动态解吸实验，考察洗脱剂pH值、流速等对树脂解吸性能的影响，测定不同条件下解吸液中OA和UA的浓度，确定最佳的解吸工艺条件。