糖心平胶囊对糖尿病大鼠心肌超微结构、血管紧张素Ⅱ及其1型受体的影响(一)
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作者：李敏, 倪青, 楚小燕, 王兆礼, 林兰
【摘要】 目的：探讨糖心平胶囊对糖尿病大鼠心肌病变的保护作用及机制。方法：80只大鼠通过腹腔注射链脲佐菌素建立糖尿病模型，并随机分为模型组、格华止组、开搏通组和糖心平胶囊大、中、小剂量治疗组，灌胃给药8周，并以10只正常大鼠作为正常对照组。分别采用放射免疫法和逆转录聚合酶链式反应法检测给药后各组大鼠心肌组织中Ang Ⅱ含量和AT1R mRNA表达水平，透射电子显微镜检测心肌超微结构的改变。结果：模型组、格华止组和糖心平中、小剂量组心肌组织中Ang Ⅱ含量和AT1R mRNA表达较正常对照组显著增高（P＜0.05，P＜0.01）。糖心平大剂量组和开搏通组心肌组织中Ang Ⅱ含量和AT1R mRNA表达低于模型组（P＜0.05，P＜0.01）。模型组心肌超微结构与正常对照组相比，心肌线粒体体积轻度增大。所有治疗组心肌超微结构较模型组有明显改善。结论：糖心平胶囊可能通过调整心肌局部肾素?血管紧张素系统的紊乱对糖尿病心肌病变产生保护作用。
【关键词】 糖心平胶囊; 糖尿病并发症; 血管紧张素Ⅱ; 血管紧张素Ⅱ1型受体; 心肌疾病; 大鼠
Methods: The model of diabetes mellitus was induced by streptozotocin (STZ) injection in rats. And the rats with diabetes mellitus were randomly divided into untreated group, metformin group, captopril group, and low?, medium? and high?dose Tangxinping group; the other ten normal rats were used as normal controls. After eight?week treatment, all rats were sacrificed to detect angiotensin Ⅱ (Ang Ⅱ) protein content and angiotensin Ⅱ type 1 receptor (AT1R) mRNA expression in myocardial tissues by radioimmunoassay and reverse transcription polymerase chain reaction (RT?PCR) respectively. The ultrastructural change in myocardial tissues was detected by transmission electron microscopy.
Results: The results of radioimmunoassay and RT?PCR showed that the content of Ang Ⅱ protein and the expression of AT1R mRNA in myocardial tissue of the untreated group was significantly increased and more than those in normal control (P＜0.05, P＜0.01). Only the content of Ang Ⅱ and expression of AT1R mRNA in high?dose Tangxinping group and captopril group were significantly lower than those in the untreated group (P＜0.05, P＜0.01). The transmission electron microscopy showed that volume of mitochondrion in myocardial tissue in the untreated group was bigger than that in normal control group. Also the volume of mitochondrion was improved in 5 treated groups, but had no significant difference when pared with the untreated group.
Conclusion: Tangxinping may adjust the disorder of renin?angiotensin system to protect myocardial tissue in rats with cardiomyopathy due to diabetes.
Keywords: Tangxinping capsule; diabetes plications; angiotensin Ⅱ; angiotensin Ⅱ type 1 receptor; cardiomyopathy; rats
糖尿病性心脏病是危害较大的糖尿病慢性并发症之一，其中糖尿病心肌病变是糖尿病患者心力衰竭和心源性猝死发病率较高的病理基础。目前认为，参与心肌病变的影响因素较多，除糖尿病直接的糖、脂代谢紊乱的作用外，心肌局部的多种血管、神经、内分泌代谢因素也介入了病变过程。近年来，对血管紧张素Ⅱ（angiotensin Ⅱ, Ang Ⅱ）及其受体在多种心血管疾病发病机制中的作用方面的研究较多。本研究拟通过观察糖心平胶囊（Tangxinping Capsule, TXPC）对糖尿病心肌病大鼠心肌Ang Ⅱ及其1型受体(angiotensin Ⅱ type 1 receptor, AT1R) mRNA表达以及心肌超微结构的影响，探讨其对糖尿病心肌病变的作用机制。
1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 实验动物 雄性Wistar大鼠90只，8周龄，体质量180～200 g，清洁级，由中国医学科学院实验动物繁育场提供（动物许可证号为01?3003），普通饲料喂养。
1.1.2 实验药品 糖心平胶囊，主要组成为黄芪、太子参、香加皮等，0.5 g/粒，相当于生药含量3.26 g，由中国中医科学院广安门医院制剂室提供；开搏通片（卡托普利片）由上海中美施贵宝制药厂生产，12.5 mg/片，批号为沪卫药准字(1995)第03300号；格华止片（盐酸二甲双胍片）由上海中美施贵宝制药厂生产，500 mg/片，批号为国药准字(2001)J?01(1)号。
1.1.3 主要试剂与仪器 链脲佐菌素（streptozotocin, STZ）购自美国Sigma公司；TRIzol试剂，购自美国Gibico公司；逆转录反应(reverse transcription, RT)试剂盒，购自美国Invitrogen公司；聚合酶链式反应(polymerase chain reaction, PCR)所需的酶及缓冲液系统为SYBR Green试剂，购自美国ABI公司；Ang Ⅱ放射免疫分析药盒，购自北京福瑞生物工程公司。5700型荧光定量PCR仪，美国ABI公司生产；FJ?2008G型自动γ免疫记数器，西安国营262厂生产。
1.2 实验方法
1.2.1 动物模型的制作 选取80只大鼠，按65 mg/kg体质量腹腔注射STZ建立糖尿病模型〔1〕。STZ临用前用pH 4.2、0.1 mmol/L的枸橼酸缓冲液配制成浓度为2%。依据注射后72 h尿糖为＋＋＋～＋＋＋＋，血糖＞16.7 mmol/L为模型成功标准。成模率约75%左右，有60只大鼠确定模型建立成功并纳入本实验。
1.2.2 给药与分组 动物成模后1个月，60只大鼠按照随机数字表完全随机法分为模型组、开搏通组、格华止组和大、中、小剂量糖心平胶囊组，每组10只，并选10只正常大鼠设为正常对照组。糖心平大、中、小剂量组分别给予糖心平胶囊2、1和0.5 g/(kg・d)灌胃（按胶囊质量计算），分别相当于正常成人量的20倍、10倍和5倍；开搏通组大鼠予开搏通2.08 mg/(kg・d)灌胃，格华止组大鼠给予格华止0.25 g/(kg・d)灌胃，分别相当于正常成人给药量的10倍。连续给药8周。正常对照组和模型组大鼠予等量的生理盐水灌胃。糖尿病大鼠不用胰岛素治疗。
1.2.3 取材及指标检测方法 动物给药8周末禁食12 h，称取质量后股静脉采血，断头处死动物，立刻开胸取出全心组织，取左室游离壁心肌约100 mg，4 ℃焦碳酸二乙酯水清洗后液氮速冻，放入－80 ℃冰箱保存准备心肌组织AT1R mRNA表达测定；另取左室游离壁心肌约100 mg －20 ℃冰箱保存准备检测心肌组织Ang Ⅱ含量。
1.2.3.1 血糖检测 静脉采血，自动生化分析仪检测静脉血糖。
1.2.3.2 心肌组织Ang Ⅱ含量测定 取左室游离壁心肌约100 mg，放入1 mmol/L醋酸1 ml预冷的EP管中，在冰浴条件下以12 000 r/min匀浆，匀浆液经考马思亮蓝法标定蛋白含量，采用放射免疫技术，以均相竞争法直接测定心肌组织Ang Ⅱ含量，用pg/mg心肌质量表示。
1.2.3.3 心肌组织AT1R mRNA表达的测定 细胞总RNA的提取参照TRIzol Reagent说明书，每只取100 mg的心肌组织，采用1 ml TRIzol试剂裂解，然后依次加入氯仿、异丙醇提取总RNA。经紫外分光光度计测定本实验RNA样品260 nm 和280 nm处吸光度值（absorbance，A），A260/A280比值在1.7～1.9之间，经电泳每组均可见18 S和28 S明显条带。
逆转录反应根据逆转录反应试剂盒要求标准进行。取总RNA 2 μl，以Oligo(dT)15为引物合成cDNA，反应总体积为10 μl。引物序列根据已克隆大鼠AT1R、磷酸甘油醛脱氢酶（glyceraldehyde phosphate dehydrogenase, GAPDH） cDNA完整序列设计，由北京赛百盛生物技术公司协助合成。AT1R上游引物5'?AAG GGC TAC CAG AGC GAT CA?3'；下游引物5'?GGT ATT G AGG TGC ACA AA?3'；扩增cDNA产物长度为275 bp。GAPDH上游引物5'?AGA T ACA ACG GAT ACA TT?3'；下游引物5'?T CTC AAG ATT GTC AGC AA?3'；扩增cDNA产物长度为309 bp。
PCR所需的酶及缓冲液系统为SYBR Green试剂，按照下列热循环参数进行PCR，50 ℃ 5 min、95 ℃ 10 min、95 ℃ 15 s和60 ℃ 1 min，均循环40次。PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳，照相记录特异性条带，然后应用激光扫描进行A值测定，以AT1R与GAPDH A值比值表示各标本的AT1R mRNA表达的相对量。
1.2.3.4 心肌组织细胞超微结构观察 取左室室壁中层组织切成1 mm3小块，2%戊二醛前固定，1%锇酸后固定，环氧树脂618包埋，LKB机切片，在透射电子显微镜下观察心肌细胞超微结构并摄像。
1.3 统计学方法 采用SPSS 11.0统计软件包进行统计学处理，计量资料数据均以x±s表示，采用单因素方差分析，组间两两比较用LSD?t法，检验水准为α=0.05。