紫苏属植物叶片氨基酸组成及含量分析(一)

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作者：蔡干蓉　吴卫　郑有良　杨文婷

　　摘 要：采用HPLC法对来自美国、日本、四川和广东等地共27份紫苏属材料叶片氨基酸组成及含量进行测定。结果表明，该属植物叶片中含有17种氨基酸，各氨基酸含量在材料间有较大变异，脯氨酸的变异系数高达59.19%。来自四川的P06-7其必需氨基酸含量达19.55 mg/g，氨基酸总量为57.65 mg/g，综合表现优良。试验结果还表明，野生紫苏的药效氨基酸和香甜味氨基酸含量均相对较高，是紫苏属植物中氨基酸含量丰富的资源。?
　　关键词：紫苏；氨基酸；HPLC法?
　　
　　1 材料和方法?
　　
　　1.1 供试材料?
　　试验共27份紫苏属植物材料，均由四川农业大学植物教研室杨光辉老师鉴定。本文将紫苏和白苏分开研究。其中紫苏种有7份材料：P06-4来自重庆南川，P06-11紫来自四川雅安，P06-16、P06-17紫来自四川芦山，P06-18来自四川崇州，P07-1来自四川遂宁，P06-31来自日本；野生紫苏种有材料6份：P06-6来自四川都江堰，P06-7、P06-9、P06-10来自四川雅安，P06-12紫来自四川资中，P06-15紫来自四川简阳；回回苏变种有材料5份：P06-1回来自广东中山，P06-13来自四川内江，P06-20 A、P06-20 B、P06-20 C来自四川成都；白苏种有材料有9份：P06-11白来自四川雅安，P06-15白来自四川简阳，P06-17白来自四川芦山，P06-30、P06-36来自美国，P06-32来自泰国，P06-33来自韩国，P06-37来自日本，P07-2来自四川广元。?
　　1.2 仪器与试剂?
　　Agilent公司1100型高效液相色谱仪（含脱气机、四元梯度泵、自动进样器进样、柱温箱、DAD检测器），Sartorius公司BP211D型电子天平，ICE公司Micromax型离心机，Millipope公司MilliQ型纯水仪，Labarey公司微量移液器Autoseienee公司溶剂过滤器，上海精科雷磁公司PHS一2C型酸度计。乙腈、甲醇、四氢呋喃均为色谱纯，由TEDIA公司提供，内标物SAR和17种氨基酸混合标样（含Asp Glu Ser His Gly Thr Ala Arg Cys- SS- CysTyr、Val、Met、Phe、Ile、Leu、Lys、Pro）以及衍生剂OPA和FMOC均由Agilent公司提供，其余试剂为分析纯。?
　　1.3 方法?
　　1.3.1 供试样品的制备?
　　采取3个月生植株上的完整健全叶片，在80℃干燥箱中烘干，粉碎，准确称取0.5 g于10 mL安瓿瓶中，加入6 mol/L的HCl 7 mL，充入高纯N2，将安瓿瓶封口，置于105℃恒温干燥箱中消化过夜。冷却后过滤，滤液浓缩近干，加5 mL0.1 mol/L的HCl溶解，取1.5 ml至1.5 ml离心管中，10000转/min离心10 min，取上清液900 ul加入100ul 5nmol/ul内标物SAR，混匀后作为供试样品。?
　　1.3.2 标准溶液的制备?
　　5 nmol/L内标液制备：精密称取SAR 22.3 mg以0.1 mol/L HC1定容至50 mL。?
　　500 pmol/L内标液制备：精密吸取5 nmol/L内标液5 mL以0.1mol/L HC1定容至50 mL。?
　　900 pmol/L氨基酸混合标液制备：精密吸取900 ul 1000pmol/L氨基酸混合标液加入5 nmol/L内标液100 ul；?
　　225 pmol/L氨基酸混合标液制备：精密吸取900 ul 250pmol/L氨基酸混合标液加入5 nmol/L内标液100 ul；?
　　90 pmol/L氨基酸混合标液制备：精密吸取900 ul 100pmol/L氨基酸混合标液加入5 nmol/L内标液100 ul。?
　　1.3.3 色谱条件?
　　样品自动柱前衍生化程序：吸取硼酸缓冲液5 ul，再吸取OPA试剂1 ul，洗针1次，吸取样品1 ul，原位混合6次。吸取FMOC试剂1 ul，洗针1次，原位混合3次，进样。?
　　色谱柱：Hypersil AA-ODS C18 2．1×200 mm?
　　流动相A：醋酸钠1.36±0.025 g，加入纯水500 mL溶解，加EDTA溶液50 ul，再加三乙胺90 ul，用1％-2％ 醋酸调pH= 7.20±0.05，再加入四氢呋喃1.5 mL，混合均匀。?
　　流动相B：醋酸钠1.36±0.025 g，加入纯水100 mL溶解，用1％一2％ 醋酸调pH=7.20±0.05，将此溶液加至乙腈200 mL和甲醇200 mL的混合物中，并混合均匀。 ?
　　柱温：40℃ 紫外检测波长：338 nm；?
　　梯度洗脱：流动相A：以0.45ml/min在0-17min由100%减至40%，17min-18min由40%减少至0；流动相B：以0.45ml/min在0-17min由0增至60%，17min-18min由60%增至100%，18.1min-23.9min流速由0.45ml/min-?0.80ml/min?，运行至24min结束。?
　　1.3.4 测定方法和数据处理?
　　分别精密量取对照品溶液和供试样品各1 ul，注入液相色谱仪，记录色谱图至脯氨酸峰出峰后即得。以3种浓度的标样制作校正表，按Agilent公司提供的氨基酸分析软件包进行数据处理。?
　　
　　2 结果与分析?
　　
　　2.1 紫苏属植物叶片中氨基酸组成及含量比较?
　　27份材料叶片中均测得17种氨基酸，其氨基酸种类较齐全。所测氨基酸中以甘氨酸平均含量最高，达6.68mg/g，其次是亮氨酸和谷氨酸，分别为4.77mg/g和4.59mg/g。与人体健康关系最为密切的赖氨酸平均含量有1.87mg/g。7种必需氨基酸总量平均为14.58mg/g，占氨基酸总量的比例为32.43%。?
　　氨基酸总量超过50 mg/g的材料共有6份（P06-11紫、P06-6、P06-7、P06-12紫、P06-15紫、P06-13），其中材料P06-7氨基酸总量最高，达57.65mg/g ，较总含量最低的材料P06-33多23.07 mg/g。17种氨基酸中有9种氨基酸（天冬氨酸、谷氨酸、苏氨酸、丙氨酸、缬氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、赖氨酸）含量均以P06-7最高，而有6种氨基酸（丝氨酸、甘氨酸、酪氨酸、蛋氨酸、苯丙氨酸、赖氨酸）含量的最低值出现在P06-33中。必需氨基酸含量变化范围在11.10 -19.55 mg/g之间，仍以P06-7为最高。非必需氨基酸含量的变化趋势与氨基酸总量的变化趋势大致相同。?
　　食物中必需氨基酸含量以及所占的比例是决定植物营养及食用价值的重要因素。从表3中可以看出，供试材料的必需氨基酸含量占总氨基酸含量的比例在0.30-0.35之间，必需氨基酸与非必需氨基酸的比例在0.42-0.53之间，基本接近与WHO/提出的E/E+N 40%，E/N 0.6 的参考蛋白模式。 ?
　　各氨基酸在材料间的变异较大。变异系数最大的是脯氨酸，达59.19%，其次是组氨酸和赖氨酸，分别为29.91%和25.63%。异亮氨酸的变异系数最小，为11.34%，其它氨基酸的变异系数均在10%-20%之间。氨基酸总量、必需氨基酸和非必需氨基酸含量的变异系数在10%-15%之间。?