Survivin-siRNA在体外诱导Panc-1细胞凋亡的实验研究(一)

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作者：邱文洪 郭凯文 宋文剑 沈关心

【摘要】 探讨RNA干扰技术抑制Survivin对人胰癌细胞株Panc-1细胞凋亡的影响。方法： 体外设计、合成针对survivin基因的小分子干扰RNA(survivin-siRNA)，应用脂质体介导survivin-siRNA转染Panc-1细胞后，MTT试验测定转染细胞的增殖抑制率，RT-PCR检测细胞survivin mRNA表达，琼脂糖凝胶电泳分析其对Panc-1细胞凋亡诱导作用。结果： 转染survivin-siRNA的Panc-1细胞增殖明显受抑制，与对照进行比较，具有显著性差异（P0.01）；经琼脂糖凝胶电泳，转染survivin-siRNA的Panc-1细胞可见到DNA梯形条带，而对照细胞未见到。结论：survivin-siRNA能够显著诱导Panc-1细胞凋亡。

【关键词】 siRNA survivin Panc-1 凋亡

　　The Study of siRNA of Survivin Gene Induced Apoptosis in Panc-1 Cell Line in Vitro Qiu Wenhong，et al(Department of Immunology, College of Medicine, Jianghan University, Wuhan 430056)Abstract Objective： To explore the effects of surviving-siRNA on induced apoptosis in human pancreatic cancer cell line Panc-1. Methods: The small interference RNA （siRNA） targeting survivin gene was designed and synthesized by transcription in vitro. Survivin siRNA was transferred into Panc-1 cell line by lipofection. The opposite livability on Panc-1 cell line was assayed with MTT test. Expression of survivin was detected by RT-PCR. Apoptosis was detected by DNA gel electrophoresis. Results: Survivin siRNA obviously inhibited the Panc-1 cells growth (P0.01). Agarose gel electrophoresis of genomic DNA from Survivin siRNA transferred Panc-1 cells showed typical DNA ladder, but DNA from other cells did not. Conclusion: Survivin siRNA could effectively induce apoptosis in Panc-1 cells.

　　Key words siRNA ；Survivin; Panc-1 cell line； Apoptosis

生存素（Survivin）是凋亡抑制蛋白(inhibitorofapoptosisprotein,IAP)家族新成员。它作为一种新的凋亡抑制因子，其组织分布和作用机制的独特性已引起国外学者的广泛关注〔1〕。深入研究RNA干扰技术的作用将为人胰腺癌的基因治疗提供一种较有效的方法。

　　1 材料和方法

　　1.1 材料

Panc-1细胞本室保存；脂质体LipfectamiM2000购自Invitrogen公司；MTT(噻唑蓝)购自SantaCruz公司；Taq DNA聚合酶，逆转录试剂盒购自MBI公司；RPMI1640培养基，TRIzol RNA分离试剂盒购自GIBCO公司；细胞凋亡-Hoechst染色试剂盒购自Beytime Biotechnology公司。

　　1.2 设计survivin特异性siRNA

根据survivin基因在GenBank中的序列，应用美国Ambion公司的设计软件设计相应的siRNA，同时在GenBank表达序列标签(EST)数据库中用BLAST检索，确认所设计siRNA序列的唯一性，人工合成针对740～761nt位碱基靶序列的两条寡核苷酸链模板。

　　1.3 合成survivin特异性siRNA

稀释上、下游模板，终浓度均为100μmol/L，分别与T7启动子序列连接，70℃5min，室温5min，37℃延伸30min，体外转录，37℃2h，siRNA的正、反义RNA结合，37℃过夜，去除前导序列和DNA模板，37℃2h，用层析方法纯化siRNA。测定合成的siRNA 260nm的吸光度(A)值，定量后-70℃保存。

　　1.4 细胞转染

采用常规方法培养Panc-1细胞，取对数期生长的细胞用于实验。将处于对数生长期的Panc-1细胞接种于6孔板，当细胞融合达70%，按照lipofectamine2000试剂盒说明书将survivin特异性siRNA（survivin-siRNA）转染Panc-1细胞。同时转染GAPDH特异性的siRNA（GAPDH-siRNA）作对照。

　　1.5 采用MTT法检测细胞增殖抑制实验

转染48h后，离心收集上述各组1×106个细胞。24ｈ后应用MTT法，在酶联免疫检测仪上测定各孔吸光度(Ａ)值，每个浓度设3个复孔，计算肿瘤细胞抑制率=（1-实验孔A值/对照孔A值）×100%。

　　1.6 转染细胞survivin mRNA表达的检测

转染48h后，离心收集上述各组1×106个细胞。按照试剂盒说明提取总RNA逆转录成cDNA，进行PCR反应检测survivin mRNA的表达。引物序列为，上游引物：5-CATGGGTGGACGTT-3'，下游引物：5-TCAATATGGCAGAGCT-3'，并以β-actin为内参照，扩增片段长度313 bp。反应条件：94℃预变性5min，94℃变性1min、50℃退火45s、72℃延伸1min，共30个循环，最后延伸10min。产物经20ｇ/Ｌ琼脂糖凝胶电泳，观察结果并拍照。

　　1.7 采用DNA凝胶电泳检测细胞凋亡

转染48h后，离心收集上述各组1×106个细胞。洗涤并重悬，加入细胞裂解液（1% NP40，20mmol/L EDTA pH8.0，50mmol/L Tris-cl pH7.5），离心取上清加入10%SDS、蛋白酶K，50℃孵育2h，再加入RNase A室温放置1h。酚、氯仿抽提，取10μl DNA， 70℃放5min后，15ｇ/Ｌ琼脂糖凝胶，4V/cm电泳3h，观察结果并照相保存。

　　1.8 统计学方法

以上实验重复3次，部分数据以平均数±标准差(±s)表示，采用SAS 软件进行统计分析。