高效液相色谱法同时测定杜仲叶药材中芦丁等3种黄酮类有效成分的含量(一)

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作者：伍庆 王兴宁 张明时 曹桂红

【摘要】 　　目的建立同时测定杜仲叶中芦丁、槲皮素、山萘酚的高效液相色谱法。方法采用Spherisorb BDS C18柱（5 μm ，250 mm×4.6 mm），以甲醇-0.1%磷酸水溶液梯度洗脱（甲醇：0 min，30%；10 min，30%；30 min，50%；40 min，60%；50 min，30%），流速1 ml・min-1，检测波长350 nm。结果样品中芦丁、槲皮素、山萘酚的加样回收率分别为96%～98%，93% ～97%，96% ～101%；芦丁、槲皮素、山萘酚的线性范围分别为0.579～5.79 μg，r=0.999 9；0.12～1.20 μg，r=0.999 8；0.109～1.09 μg，r=0.999 9。 结论贵州不同产地杜仲叶药材中芦丁、槲皮素、山萘酚的含量差异很大。

【关键词】 高效液相色谱法 杜仲叶 芦丁 槲皮素 山萘酚

　　杜仲Eumia ulmoides Oliv属国家二级保护植物，是杜仲科杜仲属的落叶乔木，中国特有植物种，系地质史上第四纪冰川运动残留下来的占生孑遗树种〔1，2〕。具补肝肾、强筋骨、安胎之功效, 主要用于治疗肾虚腰痛, 筋骨无力, 妊娠漏血, 胎动不安, 高血压病〔3〕，其皮是我国特有的名贵滋补药材,近代研究发现杜仲叶与皮含有相同的化学成分，具有相同的药理作用，杜仲叶也是各种名贵保健品的重要原料。黄酮类化合物是杜仲药材的主要有效成分之一, 具有多种生物活性，杜仲中黄酮类化合物含量的高低, 也是判断杜仲药材及其相关产品的重要指标〔4，5〕。近年来，对杜仲黄酮类含量的测定多采用比色法和高效液相色谱法〔6，7〕，测定多为单一指标芦丁的定性定量分析，对于同时测定黄酮类物质（芦丁、槲皮素、山萘酚）3种有效成分还未见报道。为了充分合理的开发利用贵州省的杜仲资源，本文采用高效液相色谱法同时对杜仲叶中的黄酮类3种有效成分进行了定性定量分析。

　　1 仪器与试药

　　Waters 515 泵, 2996光电二极管检测器(PAD) ,7725i手动进样器, Spherisorb BDS C18 （5 μm，250 mm×4.6 mm）色谱柱, Empower 色谱工作站。

　　芦丁对照品（批号086-9303），槲皮素对照品（批号 081-9003），山萘酚对照品（批号 0861-9901）均购于中国药品生物制品检定所；杜仲叶均采自贵州各杜仲产地（经贵阳中医学院刘克汉老师鉴定）；甲醇色谱纯、磷酸为分析纯；水为二次重蒸水。

　　2 方法与结果

　　2 .1 溶液的制备

　　2.1.1 对照品储备液 分别精密称取对照品适量，用60%乙醇溶解后置于25 ml的容量品，并稀释至刻度，配置成含芦丁2.795 mg・ml-1、槲皮素0.600 mg・ml-1、山萘酚0.545 mg・ml-1的对照品储备溶液。

　　2.1.2 对照品溶液 分别精密吸取对照品储备溶液1 ml，置于10 ml的容量品中，用60%乙醇溶液溶解并稀释至刻度，配置成含芦丁0.279 5 mg・ml-1、槲皮素0.060 0 mg・ml-1，山萘酚0.054 5mg・ml-1的对照品溶液。

　　2.1.3 供试品溶液 精密称取杜仲叶粉末（过60目筛）2 g，于100 ml锥形品中，加入60 ml 60%乙醇溶液，称定重量，冷浸8 h、超声提取3 h，冷却后用相应的醇浓度补足重量。经0.45 μm的滤膜滤过，续滤液供HPLC分析。
　　
　　2.2 色谱条件色谱柱为Spherisorb BDS C18 （5 μm，250 mm×4.6 mm），流动相为甲醇-0.1%磷酸水溶液梯度洗脱（甲醇：0 min，30%；10 min，30%；30 min，50%；40 min，60%；50 min，30%），流速：1 ml・min-1，柱温35℃检，检测波长350 nm。在该色谱条件下，芦丁、槲皮素、山萘酚分离良好，且不受药材中杂质的干扰。理论塔板数不小于4 000。见图1。

　　图1 芦丁、槲皮素、山萘酚对照品色谱图 （略）

　　图2 杜仲叶样品色谱图（略）

　　2.3 线性关系考察 分别精密量取对照品溶液依次进样2，5，8，11，14，17，20 μl。按“2.2”色谱条件分析，以Y（AV.S）为峰面积，X（μg）为进样量，芦丁、槲皮素、山萘酚方程分别为：Y芦丁=1 14 28X+6 91.404，r=0.999 9、Y槲皮素=2 022 916X-5 760.250，r=0.999 8、Y山萘酚=2 177 870X-6 649.655，r=0.999 9。结果表明，芦丁、槲皮素、山萘酚分别在0.579～5.79，0.12～1.20，0.109～1.09 μg间呈良好的线性关系。