银荆感冒颗粒抗乙型流感病毒的药效学研究(一)

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作者：邱召娟，朱萱萱，倪文澎，严士海，朱琼

【摘要】 　　目的研究银荆感冒颗粒对乙型流感病毒（B/京防98-96）的抑制作用。方法体外接种乙型流感病毒鼠肺适应株于狗肾细胞(MDCK)，观察银荆感冒颗粒体外抗病毒作用；体内实验①以乙型流感病毒鼠肺适应株滴鼻感染小鼠，观察14 d，计算小鼠存活率及存活天数；体内实验②以乙型流感病毒鼠肺适应株滴鼻感染小鼠，观察肺指数。结果银荆感冒颗粒体外抗乙型流感病毒EC50为3.68 mg/ml。银荆感冒颗粒10 g/kg和20 g/kg剂量组可明显延长乙型流感病毒感染小鼠存活天数，降低死亡率；银荆感冒颗粒20 g/kg剂量组可明显抑制肺指数值，抑制率为36.7%。结论 银荆感冒颗粒对乙型流感病毒有一定的抑制作用。

【关键词】 银荆感冒颗粒 乙型流感病毒 体内外 抑制

　　Abstract：ObjectiveTo investigate the inhibitory effect of Yinjingganmao granule on Influenza B Virus. Methods The inhibitory cytopathic effects(CPE) of Yinjingganmao granule were observed by MDCK cell culture. The experiment in vivo were done by the following two methods：(1) The mice were given Yinjingganmao granule for 7 days and 30 μl Influenza B Virus by nose at sequenti luce. We calculated the survival rate and days of mice 14 days later. (2) The mice were given intragastrically Yinjingganmao granule for 7 days and 30 μl Influenza B Virus by nose at sequenti luce. We calculated the lung index and observed the pathological change. ResultsThe EC50 of Yinjingganmao granule on Influenza B Virus was 3.68mg/ml. The 10g/kg and 20 g/kg groups of Yinjingganmao granule could prolong the survival days and reduce the death rate significantly. The 10g/kg and 20 g/kg groups of Yinjingganmao granule could inhibit the lung index of the infected mice and the inhibition ratio was 31.4 and 29.1% respectively. In addition, it could also lessen the pathological change.Conclusion：Yinjingganmao granule has inhibitory effect on Influenza B Virus.

　　Key wordsYinjingganmao granule; Influenza B Virus; In vivo and vitro; Inhibition

　　流行性感冒是上呼吸道传染性极强的病毒感染性疾病，在呼吸系统中发病率占首位，可引起许多并发症，重者可引起死亡。我们运用现代工艺，选用古方银翘散结合临床化裁而制成银荆感冒颗粒，作为本院院内制剂，在临床上取得了良好疗效。为了探索该颗粒剂治疗流行性感冒的机制，我们选择与呼吸道有关的乙型流感病毒，以该病毒感染小鼠为药物评价模型，通过感染小鼠存活率、存活天数、肺指数值与肺病理变化为指标来评价药效，同时结合体外实验，来观察银荆感冒颗粒对乙型流感病毒引起的细胞病变的作用。

　　1 材料与仪器

　　1.1 药物及试剂银荆感冒颗粒，江苏省中医院药剂科提供，批号050424；利巴韦林注射液，四川美大康药业股份有限公司，批号050316；RPMI Medium 1640，GIBCO公司；胰蛋白酶，上海伯奥生物技术有限公司，批号020602；HEPES，江苏科威技术服务有限公司，批号H3375；磷酸氢二钠，南京化学试剂厂，批号051207；磷酸二氢钾，广西西陇化工厂， 批号041119；碳酸氢钠，上海虹光化工厂，批号050622；新生牛血清，杭州四季青生物工程材料有限公司，批号050827；青霉素，山东鲁抗医药股份有限公司，批号8040613；链霉素，大连美罗大药厂，批号040707；乙醚,南京试剂厂,批号050628。

　　1.2 仪器

　　CO2培养箱（BB16）, Beracus公司；倒置显微镜（XSZ-D2），重庆光学仪器厂；微孔滤器，上海医药工业研究院；细胞培养板，丹麦NUNC公司；净化工作台（SW-CJ-IF）苏州安泰空气技术有限公司；FA1004型电子分析天平，上海精科天平厂。

　　1.3 病毒株及细胞株

　　乙型流感病毒 B/京防98-96，购自中国预防医学科学院病毒所，由江苏省中医院临床研究所药理实验室传代后-70℃低温冰箱保存备用；狗肾细胞(MDCK)，购自上海细胞所。

　　1.4 动物ICR小鼠，♀♂兼用，体重16～24 g，由南京青龙山动物饲养厂提供，合格证号：SCZK（苏）2001-0018。

　　2 方法

　　2.1 银荆感冒颗粒体外对乙型流感病毒的作用

　　2.1.1 MDCK细胞培养新购置的MDCK细胞，用0.25%的胰酶消化，然后加入含血清培养液适量，轻轻吹打均匀，按1∶3比例进行分瓶传代。实验前则接细胞于96孔培养板中，培养24 h后，用于实验。

　　2.1.2 病毒毒力测定将冻存的病毒液快速冻融后，按10倍稀释法稀释成10-1～10-9的不同稀释液，接种到MDCK细胞培养板中，每个浓度4个孔，每孔接种150 μl病毒液，于5%CO2，37℃静置培养，同时设正常细胞对照，4个复孔，观察细胞病变情况，以CPE不再进展时,按Reed-Muench氏法〔1〕计算病毒滴度，即该病毒的TCID50。CPE程度：－，无细胞病变；+，25%细胞病变；＋＋，50%细胞病变；＋＋＋，75%细胞病变；＋＋＋＋，100%细胞病变。

　　2.1.3 银荆感冒颗粒最大无毒浓度实验银荆感冒颗粒（浸膏），每毫升相当于4.9 g药材，首先将原浸膏稀释成1 g/ml，再用完全培养液稀释成100 mg/ml，最后用完全培养液将其分别稀释成80，40，20，10，5，2.5 mg/ml的不同浓度加入长成单层MDCK细胞的96孔培养板中，每个浓度4个复孔，每孔150 μl同时设立正常细胞对照组，置培养箱中培养，观察细胞的生长情况，观察病变情况，以不出现细胞变暗、变圆、融合、脱落等病变的最大药物浓度为该药物的无毒性浓度。

　　2.1.4 银荆感冒颗粒TC50测定根据最大无毒浓度实验结果，将银荆感冒颗粒稀释成不同浓度，加入长成单层MDCK细胞的96孔板，每个浓度4个复孔，150 μl/孔，同时设立正常的细胞对照组，置培养箱中培养，观察细胞的生长情况，观察病变情况，采用孙氏综合法〔2〕计算该药物对细胞的TC50〔2〕。CPE程度：－，无细胞病变；+，25%细胞病变；＋＋，50%细胞病变；＋＋＋，75%细胞病变；＋＋＋＋，100%细胞病变。

　　2.1.5 银荆感冒颗粒对乙型流感病毒的作用已长成单层的细胞接种剂量为10 TCID50的病毒，置37℃，5%CO2温箱孵育2 h，弃去含病毒维持液，更换含不同浓度药物的维持液，置培养箱内培养。每天观察细胞形态，连续观察3 d，记录CPE程度，同时设立正常细胞对照组、病毒对照组各四孔，采用孙氏综合法计算药物半数有效浓度(EC50)和治疗指数(TI)。治疗指数(TI)=TC50/EC50。CPE程度：－，无细胞病变；+，25%细胞病变；＋＋，50%细胞病变；＋＋＋，75%细胞病变；＋＋＋＋，100%细胞病变。