皱皮木瓜总黄酮镇痛作用的机制分析(一)

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【摘要】 目的探讨皱皮木瓜总黄酮（FLC）的镇痛作用及其镇痛机制。方法利用小鼠热板、扭体法模型和兔耳皮下K+ 渗透外周致痛模型，观察FLC的镇痛作用，并分析与Ca2+的关系。结果FLC不仅具有全身镇痛作用，还具有外周镇痛作用；其全身及外周镇痛作用可被CaCl2拮抗，被EGTA所加强。5%，10%和20%FLC呈浓度依赖性抑制50 mmol・L-1 K+诱导蟾酥坐骨神经Ca2+含量增加；10%FLC抑制10-5mmol・L-1NE诱导蟾酥坐骨神经Ca2+含量增加。结论FLC的镇痛作用机理可能与其抑制神经组织钙通道和非神经组织钙通道，减少致痛介质释放等因素有关。

【关键词】 皱皮木瓜总黄酮 钙离子 坐骨神经 镇痛作用

植物中的黄酮类化合物具有多种药理活性。近年来发现芦丁、银杏叶总黄酮、金丝桃苷和黄芩苷等生物黄酮类化合物均有较强的镇痛作用〔1～5〕。本实验室以前的研究发现皱皮木瓜的乙醇提取物具有镇痛作用〔6〕。为了进一步寻找其中的有效部位，本文利用皱皮木瓜总黄酮组分，对其镇痛作用进行了深入的实验研究。

　　1 材料

　　颅痛定（Rotundine，Rot），山西云鹏制药有限公司出品，批号20060402；CaCl2 ，武汉化工试剂有限公司产品；乙二醇双醚四乙酸（EGTA ），华中科技大学提供； 硝苯地平 （Nifedipine，Nif），湖北华中药业有限公司出品，批号20070122; 皱皮木瓜总黄酮（FLC）由三峡大学天然产物研究与利用实验室提供，经酒精回流、大孔吸附树脂分离纯化，临用时配成相应浓度备用。其他试剂均为市售产品。

　　2 方法

　　2.1 小鼠热板法取雌性昆明种小鼠50只，普通清洁级，体重18～22 g，选择其基础痛阈在10～25 s之间，随机分为5组，每组10只，腹腔注射给药。分组及用药剂量见表1。调节热板仪温度至55℃，以雌性小鼠接触热板至开始舔后足的潜伏期为基础痛阈指标，分别测得小鼠给药后30，60，90 min痛阈值。

　　2.2 小鼠扭体法取昆明种小鼠50只，普通清洁级，雌雄不拘，体重18～22 g，随机分为5组，每组10只。分组及用药剂量见表2。各组小鼠给药40 min后，腹腔注射0.6%冰醋酸0.2 ml/只，观察注射醋酸后30 min内扭体反应（后肢伸直，背部抬高，腹部凹陷）次数作为致痛的指标。

　　2.3 家兔耳皮下K+ 渗透外周致痛模型 实验取家兔30只，体重1.5～2.0 kg，随机分5组，分组及用药剂量见表3。置家兔于兔盒中，在耳根部中央动脉顺血流方向用7#针头刺入后，立即注入0.5 ml肝素进行局部抗凝处理并固定；将耳背部内、外两侧耳缘静脉近心端分别用7#注射针头沿静脉血流方向逆向刺入并引流至体外，用蛙心夹夹住静脉以阻断其回流。在耳尖部固定一金属圈，直径约0.8 cm，充以饱和氯化钾溶液棉球，作为刺激电极正极，在耳根部固定一相同金属圈，充以生理盐水棉球，作为参考电极，两电极连上BL-420E+生物机能实验系统，逐步加大刺激电流，以引起家兔挣扎时的最小刺激电流为痛阈指标,制成兔耳皮下K+渗透外周致痛模型，分别测定并记录给药前后痛阈，按以下公式，求出镇痛效应。

　　镇痛效应（%）=（给药后痛阈－给药前痛阈）/给药前痛阈×100%

　　同法测得给药前后对侧兔耳痛阈值的变化，以排除药物从侧枝循环回流至全身产生的全身镇痛效应。

　　2.4 坐骨神经钙含量的测定按文献方法制备蟾蜍坐骨神经标本。标本称重，随即将神经标本浸在4℃的任氏液中1 h，分别加入50 mmol・L-1 KCl和10-5mol・L-1 NA，刺激钙通道开放，以增加钙离子内流，继续在4℃任氏液中保存1 h后取出标本，用无钙任氏液冲洗2次，以冲去标本表面上的钙离子，滤纸吸干，放入去离子水清洗的坩锅内待消化。FLC组则在未使用激动剂前将标本浸在不同浓度的FLC中30 min，再分别放入上述相同的激动剂中，后续处理相同。所有标本分别加入混合酸（硝酸0.9，高氯酸0.1）1.0 ml在电热板上徐徐加热，消化至无色，待高氯酸冒烟时取下，加入2%HCl溶解，再加入500 ppm镧盐(促钙释放剂)，定溶后待测。采用HITACHI Z-2000型原子吸收分光光度计测定（测定波长42207 nm，灯电流10 mA，狭缝0.7 nm）。见图1～2。
　　
　　2.5 统计学处理 所有数据依据SPSS10.0 版统计软件进行t检验分析处理。

　　3 结果

　　3.1 FLC对热板法致痛实验小鼠痛阈的影响结果见表1。

　　表1 FLC对实验小鼠痛阈的影响（略）

　　与NS比较, ＊P0.05；与20%FLC比较，△P0.05；n=10

　　实验结果表明，2.0g・kg-1FLC明显延长小鼠舔足潜伏期，其延长效应能被EGTA增强，被CaCl2所拮抗。

　　3.2 FLC对扭体法致痛实验小鼠扭体次数的影响结果见表2。

　　表2 FLC对小鼠扭体次数的影响（略）

　　与NS比较,＊P0.05, ＊＊P0.01

　　结果表明，FLC明显降低小鼠扭体反应次数，表明对化学致痛模型也具镇痛作用，且镇痛作用与FLC剂量存在依赖关系。

　　3.3 FLC对家兔耳皮下K+ 渗透外周致痛模型的影响见表3。

　　表3 FLC对实验家兔的镇痛效应（略）

　　与NS比较, ＊ P0.05;与8%FLC比较，＊＊P0.05

　　由表3可见 FLC对兔耳皮下K+ 渗透致镇痛模型可显著提高痛阈，其镇痛作用能被EGTA增强，被CaCl2所拮抗。表明FLC也有很强的外周镇痛作用，且镇痛作用与钙离子有关。经测给药前后对侧兔耳痛阈值无明显改变。