叶酸偶联5?氟尿嘧啶壳聚糖纳米粒的制备及其体外性质研究(一)

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【摘要】 目的 研究叶酸偶联壳聚糖载5?氟尿嘧啶纳米粒的制备方法及体外性质。方法 根据叶酸与壳聚糖的偶联比选择最佳工艺条件,通过叶酸活性酯与壳聚糖上的氨基反应,制备叶酸偶联壳聚糖,再通过离子交联法制备叶酸偶联壳聚糖纳米粒包合5?氟尿嘧啶,从而制成载药纳米粒。结果 制备了叶酸壳聚糖偶联物,并包合5?氟尿嘧啶成纳米粒,载药量为10.4%，包封率为50.5%，8 h累积释药量达35.9%。结论 优化了叶酸偶联5?氟尿嘧啶壳聚糖纳米粒的制备工艺。

【关键词】 叶酸;纳米粒;5?氟尿嘧啶;壳聚糖

Abstract:Objective To prepare folate?conjugated 5?fluorouracil?chitosan nanoparticles (5?FU?CSNP?folate) and eva luate its property in vitro. Methods The optimal technological conditions were selected aording to the conjugated ratio of folate and chitosan. Folate?conjugated chitosan was prepared by the reaction of the activated folate ester with the amine group of chitosan. Folate?conjugated 5?fluorouracil?chitosan nanoparticles were then prepared with ionic cross?linking. Results Folate?conjugated 5?fluorouracil?loaded chitosan was prepared through different ways, and nanoparticles loading 5?FU was prepared. The encapsulation ratio of 5?FU?CSNP?folate was 50.5% and the drug loading was 10.4%. The total amount of aumulated release was 35.9% at the eighth hour. Conclusions The preparation condition of 5?FU?CSNP?folate was optimized.

Key words:folate; nanoparticles; 5?fluorouracil; chitosan

5?氟尿嘧啶(5?fluorouracil，5?FU)属抗代谢类抗癌药,对消化道恶性肿瘤及其他实体瘤具有良好的治疗效果,但单独使用常产生胃肠道毒性及骨髓抑制等毒副作用,且对肝、肾功能均有损害。近年来，通过化学修饰或将5?FU包裹在不同载体材料中制成纳米球，以形成一种新型的药物控释体系来降低5?FU毒副作用的研究已成为研究热点。叶酸（Folate，F）受体靶向就是一种近来备受青睐的新型抗肿瘤机制，它是利用叶酸受体在某些肿瘤部位的过度表达而在正常组织低水平表达的特性而实现叶酸偶联药物的靶向输送。而偶联载体以大分子物质为主有利于延长体内保留时间，提高疗效。壳聚糖是一种价廉易得、便于修饰、无毒、生物相容性好,并兼有一定抗肿瘤活性的生物大分子,广泛用于药物治疗载体。此外,近来被广泛应用到制药工艺中的纳米技术可进一步提高药物的稳定性，并实现缓释和控释给药。本课题选择壳聚糖(chitosan，CS)为抗肿瘤药物给药系统的载体材料，通过叶酸活性酯与壳聚糖上的氨基反应,制得叶酸偶联的壳聚糖，并以5?FU为抗肿瘤模型药物,通过离子交联法制得叶酸偶联的载5?FU壳聚糖纳米粒。

1 材料与仪器

1.1 材料

壳聚糖 (CS,山东奥康有限公司,脱乙酰度为95.8%)，多聚磷酸钠(TPP,天津市福晨化学试剂)，SephadexG?25葡聚糖凝胶(pharmacia)，5?氟尿嘧啶（5?FU，南通精华制药有限公司）,叶酸(上海新量化工试剂有限公司), 无水二甲基亚砜(DMSO)、二环己基碳二亚胺(D)、N?羟基琥珀酰亚胺(NHS)等试剂均为国产分析纯 。

1.2 仪器

SHZ?82恒温震荡器（金坛市富华仪器有限公司），TU1700紫外可见分光光度计（苏州岛津仪器有限公司），H?600透射电镜（HITACHI），1000HSA激光粒度分布仪（英国马尔文公司）。

2 叶酸偶联壳聚糖(F?CS)的制备和纯化

2.1 叶酸活性酯的制备

称取叶酸300 mg(0.67 mmoL),溶于无水DMSO 10 mL中,再加入D 93 mg(0.45 mmoL)和NHS 77 mg(0.67 mmoL)及三乙胺500 μL,反应过夜,过滤除去反应副产物二环己基脲（DCU）,减压蒸馏除去部分溶剂,在搅拌中逐滴滴入冰冷的含30%丙酮的无水乙醚溶液中,得到黄色沉淀物,过滤,真空干燥,得到叶酸活性酯〔1〕。

2.2 叶酸偶联壳聚糖的制备

　　称取20 mg壳聚糖（分子质量5 kD）,悬浮于5 mL无水DMSO中,磁力搅拌下逐滴滴入叶酸活性酯DMSO溶液2 mL,在适当温度（50 ℃）下反应2 h,过滤，滤渣用蒸馏水洗涤数次，用质量分数2%醋酸溶液10 mL溶解,低速离心后取其上清液,用SephadexG?25葡聚糖凝胶柱进行分离,收集，冷冻干燥后备用。

2.3 叶酸偶联壳聚糖的纯化

2．3．1 叶酸偶联壳聚糖的纯化 选用SephadexG?25葡聚糖凝胶柱进行分离,以质量分数2%的醋酸溶液为流动相进行洗脱,流速为1.5 mL/min，在叶酸波长为363 nm处监测洗脱过程，叶酸偶联壳聚糖的洗脱曲线见图1。 由图1可见,第一个峰对应的是分子量大的叶酸偶联壳聚糖,第二个峰对应的是分子量较小的游离叶酸,表明2者通过凝胶柱的分子筛效应得到了完全的分离。

2.3.2 叶酸偶联壳聚糖的紫外扫描 图2为纯化后的叶酸偶联壳聚糖及壳聚糖在醋酸水溶液的紫外扫描比较图。由图可见壳聚糖在240～500 nm范围内无紫外吸收,而纯化后的叶酸偶联壳聚糖在280 nm处显示了叶酸的特征吸收峰。结果表明叶酸已成功与壳聚糖偶联。广东药学院学报，2008，24(6)第6期 何练芹,等.叶酸偶联5?氟尿嘧啶壳聚糖纳米粒的制备及其体外性质研究

2.3.3 叶酸偶联壳聚糖制备工艺优化

2.3.3.1 叶酸标准曲线的制备 精密称取叶酸11.5 mg,置100 mL容量瓶中,用醋酸?醋酸钠缓冲液(pH=5.8)溶解并稀释至刻度,分别取0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL于10 mL容量瓶中,用醋酸?醋酸钠缓冲液稀释至刻度,以醋酸?醋酸钠缓冲液为空白,用紫外分光光度计在363 nm 处测定吸光度,以叶酸质量浓度对吸光度作标准曲线,得回归方程A=0.0142ρ+0.0034(r=0.999 8)，表明叶酸的质量浓度在5.75～34.5 μg/mL范围内与峰面积呈良好线性关系。

2．3．3．2 偶联比的计算 精密称取少许纯化后叶酸偶联壳聚糖的冻干粉,溶解于2%醋酸中,用2%醋酸定容至10 mL,然后在363 nm处测定紫外吸光度,计算每毫克叶酸偶联壳聚糖中叶酸的含量。