N-乙酰半胱氨酸对急性肺损伤大鼠肺组织水通道蛋白表达的研究(一)

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【摘要】 目的： 观察N-乙酰半胱氨酸(NAC)对急性肺损伤(ALI)肺组织水通道蛋白-1的表达,进一步探讨N-乙酰半胱氨酸对急性肺损伤(ALI)肺组织的保护作用。方法： 应用脂多糖(LPS)诱导大鼠急性肺损伤(ALI)模型,然后应用N-乙酰半胱氨酸进行干预。实验设对照组、模型组、N-乙酰半胱氨酸组，在肺损伤模型成功后24 h处死大鼠,取左叶肺组织。采用免疫组化染色, 检测N-乙酰半胱氨酸对急性肺损伤大鼠肺组织中水通道蛋白-1 (AQP-1)的表达, 利用HPIAS-2000图像分析系统测定水通道蛋白-1在以上各组中表达的平均光密度和平均阳性面积率。结果： 实验对照组肺组织表达高水平AQP-1；模型组肺组织呈浅黄色染色, AQP-1表达较低；N-乙酰半胱氨酸组肺组织表达高水平AQP-1。经q 检验，实验对照组与模型组之间，AQP-1的平均光密度及阳性面积率有显著性差异(P＜0.01），实验对照组与N-乙酰半胱氨酸组之间，AQP-1的平均光密度及阳性面积率差异无显著性(P＞0.05)。结论： N-乙酰半胱氨酸能使急性肺损伤组织中AQP-1呈高表达，对急性肺损伤组织有重要的保护作用。

【关键词】 N-乙酰半胱氨酸 肺损伤 水通道蛋白-1

　　急性肺损伤(ALI)的显著特征是大量富含蛋白的渗出液流入到肺泡腔,严重影响肺的换气功能,导致低氧血症、呼吸衰竭,病死率高达30%~40%〔1〕。目前认为,以炎性细胞因子大量释放为特征的过度全身炎症反应是ALI的主要发病基础,并伴有纤维组织增生〔2〕。但发病机制仍不十分清楚，因此给临床治疗带来诸多问题。

NAC是左旋精氨酸的天然衍生物,是一种含活性巯基化合物〔3〕。近年国内外大量实验研究结果已经证明,NAC具有强大的抗氧化和细胞保护作用。但有关NAC对急性肺损伤炎性细胞因子影响的研究尚少。我们应用脂多糖(LPS)诱导大鼠急性肺损伤(ALI)模型,然后应用NAC进行干预，观察急性肺损伤大鼠肺组织中水通道蛋白(AQP)的表达, 利用HPIAS-2000图像分析系统测定水通道蛋白-1在以上各组中表达的平均光密度和平均阳性面积率,进一步探讨NAC在防治急性肺损伤中的作用机制。

　　1 材料和方法

　　1.1 动物模型制备及分组

健康Wistar大鼠60只（雌雄不拘）, 清洁级（SPF），平均体重(180±35)g，由武汉大学实验动物中心提供。试验前禁食12h, 自由饮水。实验分组分为3组：实验设对照组（注射等量生理盐水，n=20）、模型组（经颈外静脉缓慢注射LPS 2.5 mg/kg，n=20)、NAC组（于尾静脉注射LPS前1 h分别经腹腔注射NAC(200 mg/kg)，n=20）。

　　1.2 动物标本制备

将各组动物处死，收集肺组织标本，进行组织学及免疫组织化学标本制作，取材时间为LPS注射后24h(T24)。主要试剂：① 浓缩型兔抗鼠水通道蛋白-1多克隆抗体(武汉博士德生物技术公司)；② 超敏即用型S-P通用型免疫组织化学试剂盒（福州迈新生物有限公司）；③ 显色试盒及多聚赖氨酸（北京中山生物技术有限公司）。

　　1.2 主要仪器

　　YWY781型医用微波仪（250 W，50 Hz），浙江临安电子器材厂生产；家用高压锅。

　　1.3 方法

　　1.3.1 常规HE染色

　　取材、固定、脱水、透明、切片和HE染色。

　　1.3.2 免疫组织化学S-P法检测AQP-1相关抗原

主要步骤：

① 组织切片5μm，常规脱蜡至水，蒸馏水洗；

② 3%过氧化氢，37℃孵育10 min以抑制内源性过氧化物酶活性，PBS洗4×5min；

③ AQP-1采用微波抗原修复（3档，10 min），采用高压抗原修复PBS洗4×5min；

④ 正常羊血清37℃孵育10 min以减少非特异性反应；

⑤ 一抗37℃孵育1 h，PBS洗4×5min；

⑥ 生物素标记的二抗，37℃孵育10 min，PBS洗4×5min；

⑦ 链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶复合物37℃孵育10 min，PBS洗4×5min；

⑧ DAB显色液显色，自来水冲洗终止反应；

⑨ 苏木精复染，脱水，透明，封片。

用PBS代替一抗作为阴性对照。

　　1.3.3 免疫组织化学结果判断

　　AQP-1相关抗原以细胞质出现棕黄色颗粒为阳性反应。阴性对照除细胞核染成蓝色外，胞核和胞浆内无棕黄色反应物。

　　采用HPIAS-2000高清晰度彩色病理图文报告管理系统（同济千屏影像公司）对AQP-1的表达进行定量分析，每张切片随机选取5个完整而不重叠的高倍镜视野（×400），测定AQP-1每个视野下阳性反应的平均光密度、阳性反应面积和所有细胞总面积，计算阳性面积率。以每例5个视野的平均光密度、阳性面积率的平均值作为该例的测量值（阳性面积率＝单位面积中阳性反应的总面积/单位面积中细胞的总面积×100％）。

　　1.4 统计学处理

对各组免疫组织化学反应阳性颗粒的平均光密度、阳性面积率作单因素方差分析和SNK-q检验，检验水准α为0.05。

　　2 结果

对照组肺组织中AQP-1呈高表达,可见肺组织内分布棕黄色颗粒。模型组肺组织AQP-1呈低表达 ,可见肺组织内有少量的棕黄色颗粒；NAC组肺组织中AQP-1呈高表达,可见肺组织内分布棕黄色颗粒。图像分析结果显示：对照组AQP-1表达的平均光密度为 0.3751±0.0572；模型组AQP-1表达的平均光密度为0.1697±0.0327；NAC组AQP-1表达的平均光密度为0.3573±0.0489。对照组AQP-1蛋白表达的阳性面积率0.2984±0.0452：模型组AQP-1表达的阳性面积率为0.0986±0.0371；NAC组AQP-1表达的阳性面积率为0.2758±0.0453。经单因素方差分析，组间有显著性差异（P＜0.01）。经q 检验，对照组与模型组，模型组与NAC组之间，AQP-1的平均光密度及阳性面积率有显著性差异(P＜0.01），对照组与NAC组之间，AQP-1的平均光密度及阳性面积率的差异无显著性(P＞0.05) 。见表1。表1 对照组、模型组及NAC组AQP-1表达的平均
光密度和阳性面积率（略）注：* 对照组与模型组比较，P＜0.01；# 模型组与NAC组比较，P＜0.01；△ NAC组与对照组比较，P＞0.05。