妍婷颗粒对LPS诱导小鼠脾细胞产生IL-1β的影响(一)

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【摘要】 　　目的研究中药复方妍婷颗粒对脂多糖（LPS）诱导小鼠脾细胞产生白介素-1β（IL-1β）的影响，初步探讨妍婷颗粒对慢性盆腔炎免疫调节的内在机制。方法对经LPS诱导的小鼠脾细胞给予不同浓度妍婷颗粒含药血清进行干预，用ELISA法检测上清液中IL-1β含量，用RT-PCR法检测细胞中IL-1β mRNA的表达。结果①正常小鼠脾细胞合成和分泌少量IL-1β，经LPS诱导后IL-1β分泌量明显升高（P0.01），IL-1β mRNA表达增强。②不同浓度妍婷颗粒干预呈剂量依赖方式降低LPS诱导的小鼠脾细胞IL-1β的分泌量与表达（P0.01）。结论妍婷颗粒具有抑制LPS刺激小鼠脾细胞产生IL-1β的作用，据此推测妍婷颗粒抗炎、免疫调节作用机理可能与其抑制脂多糖介导的IL-1β释放有关。

【关键词】 妍婷颗粒 脂多糖 小鼠脾细胞 白介素-1β

　　妍婷颗粒方为导师侯丽辉教授多年临床经验与中医理论相结合，总结出的治疗慢性盆腔炎的经验方，已在临床广泛应用多年，且疗效显著。慢性盆腔炎是妇科常见病、多发病，有缠绵不愈、易于复发的特点，近年其发病率呈上升趋势，因此对慢性盆腔炎的认识与研究日益广泛和深入。IL-1具有广泛的免疫调节、致热、介导炎症等作用，是慢性盆腔炎发生发展的一种重要细胞因子。本研究观测妍婷颗粒对LPS诱导小鼠脾细胞产生IL-1β的影响，从分子免疫学角度探讨妍婷颗粒治疗慢性盆腔炎的机理和有效性。

　　1 器材

　　1.1 仪器与试剂超净工作台（苏州净化）， 二氧化碳培养箱（SHEL・LAB）， 台式高速离心机(BECKMAN)， 电热鼓风干燥箱（天津泰斯特）， AB204型电子天平(Sartorius)，磁力加热搅拌器78-1（江苏金坛）， 双蒸水馏器(MILLI-Q)，752型分光光度计（上海菁华科技仪器有限公司）， PCR仪(Eppendorf), 稳压稳流电泳仪（北京市六一仪器厂）。

　　改良型RPMI-1640培养液(Hyclone)，胎牛血清（杭州四季青），D-PBS（北京中山金桥）， LPS (Sigma)，Trizol(Lnvitrogen), 引物(Sangon), 氯仿（天津市天大化学试剂厂），异丙醇（天津市恒兴化学试剂制造有限公司），琼脂糖(Solarbio)，PCR所需试剂购自Promega及TakaRa公司，ELISA试剂盒（北京北方生物技术研究所）。

　　1.2 动物6～8周龄昆明雌性小鼠，体重20～25 g，由黑龙江中医药大学实验动物中心提供。

　　1.3 药物 妍婷颗粒方组成：丹参、赤芍、元胡、三棱、莪术、红藤、败酱草、皂刺、川楝子。药物来源于黑龙江中医药大学附属第一医院制剂室，制成中药颗粒剂，蒸馏水溶解，最后浓缩含生药浓度为1.75 g/ml。

　　2 方法

　　2.1 含药血清的制备取体重20～25 g的正常昆明雌性小鼠，按人鼠体重比换算后，以妍婷颗粒方灌胃（20 ml/kg，约相当于成人用量的7倍），2次/d ，连续3 d，最后1次给药后2 h，颈动脉取血，以2 000 r/min离心5 min，分离血清，并于57℃灭活（30 min），－20℃冻存备用〔1〕。

　　2.2 小鼠脾细胞的分离培养小鼠颈椎脱位处死，置75%乙醇中浸泡3～5 min，仰卧位，无菌取脾脏，用D-PBS液冲洗，置于平皿中，移入超净工作台，再以滤过的D-PBS快速、充分洗涤后，置于烧杯上的200目不锈钢网，将脾组织用眼科剪剪成小块，用注射器芯研磨脾，至脾呈白色絮状，D-PBS液冲洗过滤脾细胞，收集细胞悬液无菌离心管中，1 500 r/min离心10 min，使细胞沉淀，弃上清，再以D-PBS液洗涤细胞2次，RPMI-1640培养液洗涤细胞1次(均以1 500 r/min离心10 min)。以RPMI-1640培养液（含10%胎牛血清，含有青霉素、链霉素各100 u/ ml）悬浮细胞，0.4%台盼蓝染色显示活力，细胞存活数大于90%，调整细胞密度，按1×106/ml密度接种细胞，置37℃，5%CO2培养箱中培养。培养12 h后加LPS及不同浓度妍婷颗粒进行干预（LPS浓度为10 μg／ml〔2〕；妍婷颗粒浓度分别为培养基的5%，10%，20%〔1〕）。

　　2.3 实验分组实验分组为正常组；LPS处理组（10 μg／ml）；5%妍婷颗粒＋LPS处理组；10%妍婷颗粒＋LPS处理组；20%妍婷颗粒＋LPS处理组。

　　2.4 实验检测给予LPS及妍婷颗粒干预24 h〔3〕后收集上清及细胞。

　　2.4.1 培养液上清中IL-1β含量测定收集上清液－20℃冰箱保存，按ELISA试剂盒说明进行检测。

　　2.4.2 RT-PCR法检测细胞中IL-1β mRNA的表达用Trizol提取细胞总RNA,测总RNA纯度和含量,逆转录成cDNA, IL-1β的上游引物为:5’-AGG CTC CGA GAT GAA CAA-3’；下游引物为: 5’-AAG GCA TTA GAA ACA GTC C-3’, 产物长度为464bp, PCR总反应体为25μl。扩增条件为：95℃预变性5 min，然后在90℃ 30 s，52.5℃ 30 s，72℃ 30s条件下循环30～35次，最后72℃延伸10 min。PCR产物以 15 g/L琼脂糖凝胶电泳检测,自动凝胶成像分析仪下观察并保存图像，IL-1β相对含量以“（细胞因子基因表达密度/GAPDH表达密度)×100%”表示〔4〕。

　　2.5 统计学分析实验数据用±s表示,采用SPSS11.0for windows统计软件进行统计学处理分析,组间比较采用方差分析。