利用重组OGDC-E2检测M2抗体及其临床意义(一)

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作者：陈燕，姚定康，周晔，朱烨，蒋廷旺，邓安梅　仲人前

【关键词】 OGDC-E2检测

【摘要】 目的 重组表达人OGDC-E2融合蛋白，并用于检测自身抗体。方法 重组表达的OGDC-E2，分别采用免疫印迹法（IBT）法和酶联免疫吸附试验（ELISA）方法检测PBC患者的M2抗体。50例确诊的PBC患者为PBC组，以其他肝病患者70例、自身免疫病患者70例和健康体检者70例作对照。结果 50例确诊的PBC患者中41例OGDC-E2抗体阳性，9例阴性，阳性率为82.0%。而疾病对照组和健康体检者血清中M2抗体检测均为阴性。结论 用重组人2-氧戊二酸脱氢酶复合物E2亚单位检测M2抗体，有较好的敏感性及一定的特异性，有助于临床对PBC的诊断。

　　【关键词】 2-氧戊二酸脱氢酶复合物E2亚单位；原发性胆汁性肝硬化；免疫印迹法；酶联免疫吸附试验；自身抗体

　　Detection of anti-M2 autoantibody using rebinant OGDC-E2
　　【Abstract】 Objective To detect the level of anti-M2 autoantibody using rebinant OGDC-E2.Methods We purified rebinant OGDC-E2 by Ni2+ affinity chromatography column and then established Western blotting test(WBT) and enzyme linked immunosorbent assays (ELISA) to detect anti-M2 autoantibody in the sera of patients with primary biliary cirrhosis(PBC).Results Among 50 sera from PBC patients,41 were positive,all of controls were negative.Conclusion The rebinant OGDC-E2 could be used to detect anti-M2 autoantibody specially and sensitively,helpful for diagnosis of PBC.

　　【Key words】 OGDC-E2;primary biliary cirrhosis;immunoblotting;enzyme linked irnmunosorbent assay;autoantibody

　 原发性胆汁性肝硬化（primary biliary cirrhosis,PBC)是一种自身免疫性疾病，主要表现为肝内小胆管进行性破坏伴门脉炎症性改变，最终导致肝纤维化及肝硬化〔1〕。高滴度的抗线粒体抗体（AMA）是本病的特征，而M2又是PBC的特异性抗体。2-氧戊二酸脱氢酶复合体（OGDC-E2）为M2的靶抗原的组分之一。OGDC-E2的抗原表位位于内酯酰区，在PBC患者血清中的阳性率为39%~88%〔2，3〕。笔者采用免疫印迹法（IBT）和酶联免疫吸附试验（ELISA），探讨用重组抗原OGDC-E2检测M2抗体在PBC诊断中的应用价值，为PBC的早期发现和临床诊断提供依据。

　　1 材料和方法

　　1.1 研究对象 2003年4月~2005年8月在我院就诊并被确诊为PBC的患者50例为观察对象（PBC组），其中男3例，女47例，男女比例为1∶16。年龄42~69岁。以2005年间在我院就诊的其他肝病患者70例、自身免疫病患者70例、健康体检者70例作对照。

　　1.2 诊断标准 PBC的诊断符合2000年美国肝脏病学会（AASLD）推荐的诊断指南：排除甲、乙、丙、戊、庚型病毒性肝炎；肝功能异常，有胆汁淤积的生化改变（主要是碱性磷酸酶、γ-谷胺酰转肽酶升高）且无其他原因解释；血清抗线粒体或M2抗体阳性；同时AMA≥1∶40〔4〕。

　　1.3 方法

　　1.3.1 重组抗原纯化 将特异性扩增OGDC-E2 cDNA并定向插入高效　　表达载体PET28a(+），转导入宿主菌E.coli.BL21，经IPTG诱导后表达，在变性条件下用带6个组氨酸的Ni-NTA琼脂糖纯化，获得高纯度的重组OGDC-E2〔5〕。

　　1.3.2 重组融合抗原IBT侧M2抗体 将重组蛋白OGDC-E2经SDS-PAGE电泳后转印至硝酸纤维素膜，用含3%BSA的PBS（pH 7.4）封闭1h；而后依次加入血清、辣根过氧化物酶（HRP）标记的兔抗人IgG抗体，加入3，3-二胺联苯胺溶液和30%H2O2，观察反应条带。同时用正常人血清作阴性对照。

　　1.3.3 ELISA测M2抗体 重组融合抗原OGDC-E2包被微孔板，首次将血清作1∶15稀释进行常规ELISA检测，测A450nm。对超过1个A450nm值者继续作系列稀释。设相应的血清稀释液抗原抗体，反应产物在450nm产生的1个吸光度A值为1个抗体单元（U），各样品抗体单位为A值数字X稀释倍数。

　　1.4 统计学方法 用Student's检验分析组间差异。