胎儿微嵌合体对Graves病动物模型制备的影响(一)
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作者：蒲丹，郭辉，马爱群，施秉银
【摘要】 目的 通过分析胎儿微嵌合体对Graves病(GD)动物模型制备的影响，探讨胎儿微嵌合体在产后GD发病中的机制。方法 应用重组人Ad?TSHR289免疫BABL/c小鼠制备GD模型，随机分组分别配对致妊娠中期或分娩结束后2周。HE 染色行甲状腺组织的病理学检查，Real?time PCR测定甲状腺内Y染色体特异性基因序列SRY。结果 GD动物模型的成功率在单纯免疫组为61.5%，免疫妊娠组为38.5%，免疫生育组为76.9%，三组间存在显著性差异(P0.05)。SRY基因的检出率在GD妊娠组中为84.6%，在妊娠对照组中为62.5%，两组间存在显著性差异(P0.05)。分娩结束后2周，SRY在GD生育组中仍有53.8%的检出率，显著高于生育对照组中的12.5%(P0.05)。并且，甲状腺内SRY基因的相对表达量在GD成模小鼠中较未成模小鼠显著升高(妊娠组：0.82±0.07 vs. 0.34±0.16；生育组：0.58±0.12 vs. 0，P0.05)。结论 胎儿微嵌合体在BABL/c雌鼠GD成功模型中检出几率较GD未成模者更高，SRY基因的相对表达量更高，提示胎儿微嵌合体可能参与了产后GD的发病。
【关键词】 Graves病 胎儿微嵌合体 动物模型
ABSTRACT: Objective To explore the influence of the fetal microchemirism in the thyroid tissue on the Graves? disease (GD) animal model. Methods Mice in experimental group were injected with Ad?TSH289 (5×108IU) to construct the GD animal model, and when the immunization was over, the experimental group was randomly divided into three parts again: two groups were mated with male mice until two weeks of pregnancy or two weeks post?partum while the other group was simple immunized with Ad?TSH289 only. SRY was tested by real?time PCR. Thyroid tissue was stained with HE for pathological examination. Results Histological examination of the thyroid gland revealed that 61.8% of simple immunized mice had goiter, the suess rate of GD animal model was 38.5% in pregnancy group, but 76.9% in postpartum groups (P0.05). The difference in the detection rate of SRY gene between GD pregnant mice and healthy pregnant mice was significant (84.6% vs. 62.5%, P0.05). And the difference in the detection rate of SRY gene between GD post?partum mice and healthy post?partum mice was also significant (53.8% vs. 12.5%, P0.05). The relative expression level of SRY gene was higher in suessful GD animal model group than in failure GD animal model group (0.82±0.07 vs. 0.34±0.16 in pregnancy groups; 0.58±0.12 vs. 0 in post?partum groups, P0.05). Conclusion The detection rate of intrathyroidal fetal microchimerism was more higher in GD model than in failure model. We propose that fetal microchimerism is a candidate mechanism for the modulation of Graves? disease in pregnancy and the post?partum period.
KEY WORDS: Graves? disease; microchimerism; animal model
自身免疫性甲状腺疾病(autoimmune thyroid disease, AITD)主要包括Graves?病(Graves? disease, GD)、桥本甲状腺炎(Hashimoto?s thyroidise, HT)和特发性甲减。女性发生AITD的危险是男性的5～10倍，且呈现随年龄增加而增加的趋势。临床中经常看到某些自身免疫性疾病在妊娠时缓解，而在分娩后随即加重的现象，即便是正常孕妇，在产后出现AITD的几率也高达10%左右[1]。对自身免疫性甲状腺炎动物模型的研究表明，雌激素和孕激素可加剧甲状腺炎的程度，睾酮可以减弱、甚至逆转这种刺激作用，因此推测女性激素对AITD的发生有一定影响。但是，妊娠和分娩诱发AITD的机制尚不清楚[1]。在妊娠期，为了保证胚胎不遭受母体的排斥，孕妇的免疫活性受到抑制，而这种生理状况下母体免疫活性的抑制，使得胎儿细胞进入母体、与母体细胞成分形成嵌合状态(即胎儿微嵌合体)成为可能[2]。而在妊娠结束后，母体免疫活性恢复甚至超过原有水平，这时存在于母体组织内的胎儿微嵌合体作为一种异体抗原成分，会象异体移植后慢性移植物抗宿主病(graft?versus?host disease, GVHD)那样，是产后AITD高发的原因之一吗？这是值得我们思考的问题，因此也就有了本文在此问题上的初步探索。本研究将利用表达TSHR (thyrotropin receptor, TSHR)A亚单位的腺病毒免疫小鼠的方法制备GD动物模型，研究妊娠对GD模型制备的影响。
1 材料与方法
1.1 材料
PSV2?neo?TSHR?289由美国加州大学医学院CHEN CR教授友情提供。质粒提取和纯化试剂盒购自上海博亚生物技术有限公司；DNA连接试剂盒、限制性内切酶、DNA marker、Taq酶购自日本TaKaRa公司；AdMaxTM Kit D、Ad?null购自加拿大Microbix公司；DNA保存液购自天泽基因公司；Real?time PCR试剂盒购自德国APPLICHEM公司；引物合成由上海生工基因技术公司完成。实时荧光定量PCR仪(MyIO)、核酸电泳仪为美国BIO?RAD公司产品；凝胶成像系统为美国BIO?SENS公司产品。
114只健康清洁级BABL/c小鼠，6～8周龄，23～28g，由第四军医大学实验动物中心提供。48只雌性用于GD动物模型的制备，24只作为健康对照，42只雄性用于配对。实验动物依据分组不同分笼饲养，饲养条件符合清洁级实验动物的设施标准。
1.2 方法
1.2.1 表达A亚单位(TSHR289)的重组腺病毒的构建[3]
EcoRⅠ和XbaⅠ分别双酶切pSV2?neo?TSHR289和pUC18，回收867bp目的基因片段，与载体片段连接、转化、筛选得到重组质粒pUC18?TSHR289，再用EcoRⅠ+SalⅠ酶切pUC18?TSHR289，回收867bp目的基因片段与EcoRⅠ+SalⅠ酶切pDC316后得到的载体片段重组为pDC316?TSHR289，测序后大量提质粒。
1.2.2 重组腺病毒载体Ad5?TSHR289的包装与纯化[3]
将重组质粒pDC316?TSHR289和重组腺病毒骨架质粒pBHGloxdel E13cre共转染239细胞，收获病变细胞混悬液后，冻融3次，离心，取上清，用DNase酶消化后，用0.45μm的滤膜过滤，阴离子交换柱层析纯化。一次性滤器过滤除菌，得到无菌的纯化病毒，分装保存-70℃冰箱中备用。经典方法测定病毒制品TCID50值，Ad?TSHR289滴度为2.5×1010IU。
1.2.3 动物免疫
将72只BALB/c雌鼠随机分为免疫组和正常健康组。免疫组48只，用Ad?TSHR289 5×108IU/次经胫前注射免疫，每3周1次，共3次。在免疫结束后，死亡小鼠9只，剩余免疫小鼠随机分为3组，各13只。不进行配对称为单纯免疫组；配对至妊娠中期称为免疫妊娠组；配对至生育后2周称免疫生育组。正常健康组共24只，其中8只配对妊娠，8只妊娠生育，8只不加任何干预。免疫组和健康组均按雌雄比例1∶1分笼配对。眼球取血处死小鼠，无菌操作下分离甲状腺，一叶甲状腺以40mL/L甲醛溶液固定；另一叶浸入DNA保存液中备用。
1.2.4 甲状腺组织的病理学检查
石蜡包埋后，切片作常规HE染色，光学显微镜下观察组织形态学的改变。
1.2.5 Real?time PCR测定甲状腺内Y染色体特异性基因序列SRY
引物序列根据基因序列库，应用PE APPLIED BIOSYSTEM 设计的引物表达软件设计，具体如下，SRY前引物：5＇?TGAACTAAGGAA?3＇，后引物5＇?TTATGGGAGAACGGCAGA?3＇；内参照基因β?actin前引物：5＇?TGAACTAAGGAA?3＇，后引物：5＇?TTATGGGAGAACGGCAGA?3＇。