基质干细胞与Schwann细胞联合移植治疗大鼠 脊髓损伤后后肢功能的评价(一)
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作者：陈冰，张振兴，王道奎，张强，王玉亭，王金鹏
【摘要】 目的 探讨基质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）与Schwann细胞（Schwann cells，SCs）联合移植对大鼠脊髓损伤后后肢功能恢复的影响。方法 体外分离纯化大鼠骨髓基质干细胞和Schwann细胞，取SD大鼠30只随机分为对照组、局部移植组和局部、静脉联合移植组，在手术显微镜下制作脊髓横断模型，局部移植组只在损伤局部注射MSCs与Schwann细胞，局部、静脉联合组在局部注射后24 h内经尾静脉注射MSCs与Schwann细胞，对照组在损伤局部注射PBS液。分别于术后7天、14天、21天、28天、35天、42天通过脊髓运动功能评分（BBB评分）观察大鼠后肢功能的恢复情况。结果 局部移植组和局部、静脉联合移植组的评分均显著高于对照组（P0?05），但局部移植组与联合移植组间无显著差异（P>0?05）。结论 基质干细胞与Schwann细胞联合移植能有助于脊髓损伤（spinal cord injury，SCI）的恢复。
【关键词】 基质干细胞；许旺细胞；移植；脊髓损伤；大鼠
〔Abstract〕 Objective To explore the effects of both MSCs and SCs co-transplantation on the function recovery in rats hind legs.Methods Separating and purifying MSCs and SCs of rats extracorporeally.Taking 30 rats and randomly divided them into a control group，a partially-transplanted group and a co-transplanted group of part and vein.And then made models of crossed spinal cord under the operation microscope.The partially-transplanted group only injected MSCs and SCs in the injured parts.The co-transplanted group of part and vein injected MSCs and SCs through end intravenous injection after the partial injection within 24 hours.The control group injected PBS in the injured parts.Observed the function recovery in rats hind legs through the marks marked by BBB in 7 d，14 d，21 d，28 d，35 d，42 d separately.Results Both of the marks of the partially-injected group and the co-transplantation group of part and vein were much higher than that of the control group （P0?05）.But the partially-injected group had no clear differences from the co-transplantation group of part and vein （P>0?05）.Conclusion MSCs and SCs co-transplantation can help the recovery of the SCI.
〔Key words〕 mesenchymal stem cells;Schwann cell;transplantation;spinal cord injury;rats
实验将大鼠基质干细胞（MSCs）和Schwann细胞（SCs）联合移植于大鼠脊髓横断损伤处及通过静脉移植，观察大鼠后肢功能的恢复，从而反映其对脊髓损伤（spinal cord injury）的修复作用，为临床提供参考。实验在2007年7~11月完成。
1 材料与方法
1?1 材料 取雌性SD大鼠30只，体重（250±20）g，由解放军第89医院动物实验室提供。MSCs及Schwann细胞由潍坊市人民医院中心实验室分别从SD大鼠的骨髓和坐骨神经中提取、分离、培养和纯化，培养20天。
1?2 实验动物分组 30只成年SD大鼠被随机分成三组，每组10只。对照组（A组）在损伤局部注射PBS液，局部移植组（B组）在脊髓横断损伤局部注射MSCs及SCs混合液，局部、静脉联合移植组（C组）在局部注射后24 h内经尾静脉注射MSCs及SCs混合液。
1?3 动物模型制作 将大鼠每只一笼单独饲养，即适应性饲养一周后，在术前一天分别给予BBB评分。大鼠经氯胺酮腹腔麻醉（60 mg/100 kg），将其俯卧位固定于木板上，背部剃毛，碘伏原液消毒。在手术显微镜下（LEICA MS two），沿T9~11棘突作后正中纵向切口，暴露并咬除T9~11棘突，咬除T10椎板及T9、T11的部分椎板，显露硬脊膜。以保险刀片自制成尖刀片在平T10椎体中点位置横行切断脊髓。A组于术中在损伤局部注射培养液，B组和C组在术中即移植MSCs及SCs混合液，各层均以5-0丝线严密缝合。C组在术后24 h内通过尾静脉移植MSCs及SCs混合液。术后每日人工辅助排尿至其能自主排尿，每日腹腔注射青霉素1 ml（10万IU/ml）。其中早期死亡3只均予以补充。
1?4 移植 A组在损伤局部注射PBS液，每例0?5 ml，B组仅在术中移植MSCs+SCs，浓度为4?26×108/ml，采取脊髓损伤局部注射的方法，每例0?5 ml，注射后各层严密缝合。C组在通过上述方法移植后，于术后24 h内通过尾静脉注射移植MSCs+SCs，浓度为3?8×108/ml，每例注射0?4 ml。
1?5 脊髓运动功能评分 各组大鼠在术前及术后7天、14天、21天、28天、35天、42天分别行脊髓运动功能评分。评分人员由非实验人员担任，事先熟悉评分标准，采用双盲对照的方法。评分时在每日17时进行，将大鼠置于宽阔的平地，任其自由爬行，观察其后肢运动的情况，时间为4 min。评分标准参照Basso等提出的大鼠胸段脊髓损伤后功能评判标准（BBB评分）对各实验组动物后肢的运动功能进行评分（评分为0~21共22级，0级为无后肢活动，21级为正常行走活动）。
1?6 统计学方法 数据采用单因素方差分析（ANOVA）处理，均应用SPSS 15?0统计软件进行分析，P0?05为差异有统计学意义。
2 结果
BBB评分结果见表1。结果显示在各个时间点，B组C组评分均高于A组，差异有统计学意义（P0?01），移植组较对照组功能恢复快。而B组与C组间无统计学差异（P>0?05）。
3 讨论
随着社会经济的发展，各种外伤造成的脊髓损伤（spinal cord injury，SCI）成为常见病及多发病，且SCI致残率高。SCI的重要病理变化是轴突的中端，长传导束的损伤会导致损伤平面以下感觉与运动障碍。SCI的治疗方法虽然很多，但疗效往往不够肯定。细胞移植是近20年来研究比较多、发展比较迅速的一种方法。移植细胞主要有胚胎干细胞（embryonic stem cells，ESCs）、神经干细胞（neural stem cells，NSCs）、嗅鞘细胞（olfactory ensheathing cells，OECs）、Schwann细胞（SCs）、骨髓基质干细胞（MSCs）和成纤维细胞等。 表1 移植后不同时间点BBB评分情况 注：各时间点B组、C组均与A组有显著差异，P0?01，各时间点B组与C组间均无显著差异，P>0?05
3?1 骨髓基质干细胞 MSCs可以从患者自身骨髓抽取，取材方便且痛苦少，又克服了有关伦理学的难题，而且MCSs可在体外快速培养扩增，并定向诱导分化，同时MSCs移植后可在体内长期生存，排斥反应低。该实验MSCs取材于大鼠的股骨。MSCs为非造血干细胞，是一种多潜能干细胞，研究表明在体外给予不同的培养条件其可以定向分化，且可以分化为不同胚层来源的细胞〔1〕。人们发现在体内环境中MSCs能被诱导分化为具有星状胶质细胞形态的细胞，并表达神经胶质原纤维蛋白（GPAP）〔2〕，也可以分化为表达NN、NF（神经微丝）等神经元标志蛋白的细胞〔3〕，MSCs植入体内后其分化方向与组织局部的因子相关〔4〕。MSCs移植可以经静脉移植也可以直接移植到损伤部位。有研究表明无论通过静脉还是动脉移植，MSCs均表现出对缺血、损伤病灶的趋化性〔5〕，移植的MSCs可自血管内向脊髓损伤区域迁徙并在宿主脊髓内存活的这种方向性可能与局部微环境改变产生一定的信号有关〔6〕。另外也有研究表明在SCI损伤部位注入MSCs，移植组大鼠的神经功能恢复情况好于对照组〔7~9〕。骨髓基质干细胞向神经细胞分化起到细胞替代作用，这与神经通路建立广泛的传入、传出联系，甚至重建神经环路和髓鞘再生等，诱导神经保护作用〔10〕，可能是其发挥作用的机制。我们这项研究也表明无论是单纯在损伤局部移植还是联合静脉移植都对SCI的恢复有明显的帮助，移植组结果均优于对照组，这也进一步证实了MSCs移植有助于脊髓损伤的恢复。