犬骨髓CD34+细胞种植人工血管置换后短期内皮化的实验研究(一)

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作者：于振海　张曙光　李光新　王坤　阮长乐

【摘要】 目的：探讨骨髓CD34+细胞种植于常用膨体聚四氟乙烯（expanded polytera fluoroethylene，ePTFE） 人工血管和涤纶人工血管后二者的内皮化程度。方法：选杂种犬8条，依支架覆膜不同分为ePTFE组和涤纶组，每组实验犬2条，对照犬2条。实验犬采自体骨髓，提取CD34+细胞种植覆膜支架，对照犬采用单纯自体血预凝覆膜支架。将人工血管植入犬的下腔静脉和腹主动脉。在术后第10、30天观察植入的人工血管通畅情况，采用免疫组织化学方法鉴定内膜细胞来源，在光镜和电镜下观察人工血管新生内膜表面内皮化情况。结果：术后第10天实验组与对照组差异无统计学意义；术后第30天腔面新生内膜内皮细胞自人工血管吻合口向中间逐渐减少（P0.05）；而对照组内膜表面第10、30天均无内皮细胞覆盖。结论：经纯化的CD34+细胞种植于ePTFE和涤纶人工血管,均获得理想的内皮化。

【关键词】 人工血管・CD34・血管内膜

【ABSTRACT】 Objective: To investigate the endothelialization of artificial blood vessel seeded by CD34+ stem cells. Methods: Eight crossbred dogs were randomized into two groups. Artificial blood vessel covered with ePTFE or Dacron were implanted into the abdominal aorta artery（AAA） and inferior vena cava （IVC）.In each group,two dogs were implanted by prostheses seeded by CD34+ stem cells, two dogs were implanted by autogenous blood only as control.The prostheses were explanted at ten or thirty days.Light and electron microscopy were applyed to examine endothelialization of prostheses. CD34 factor stain were used to identify endothelial cells. Result: Confluent endothelial cells appeared on the neointima of seeded prostheses.There were no endothelial cells in the no-implated prostheses. Conclusion: Rapid endothelialization can be achieved in the prostheses covered with ePTFE or Dacron which are implanted by CD34+ stem cells.The effect of Dacron’s endodermis implanted by CD34+ stem cells is better than ePTFE’s.

【KEY WORDS】 Blood vessel prosthesis ・CD34・Tunica intima

　　人工血管作为一种非生物材料，其近远期通畅率是血管外科医师最关心的问题。资料统计人工血管重建膝下动脉的 5年通畅率仅为 38.9 %〔１〕。有研究表明以提纯的骨髓CD34+细胞种植人工血管具有较高的特异性，能够明显提高人工血管新生内膜的质量和数量，避免了新生内膜钙化灶的形成，大大改善了患者的远期预后〔２〕。

　　国内已有学者从骨髓和脐血中获得内皮细胞祖细胞，经体外诱导成内皮细胞，短期培养扩增后用于人工血管内皮化的研究〔３〕。本研究以骨髓CD34+细胞种植目前临床常用的两种小口径（6 mm）人工血管―膨体聚四氟乙烯（expanded polytet rafluoroethylene, ePTFE）和涤纶人工血管，替代实验犬的腹主动脉和下腔静脉，观察短期内腔面内皮细胞覆盖情况,为寻求一种具有抗血栓和抑制新生内膜增生的半生物化人工血管提供实验依据。

1　材料与方法

1.1　实验动物　济南地区杂种犬8条,雌雄不限,体质量（15.8±1.4） kg，犬龄1～2岁。随机分为ePTFE组和涤纶组，每组4条，包括实验犬2条和对照犬2条。

1.2　CD34+细胞的分离　戊巴比妥钠（30 mg/kg）腹腔麻醉,无菌条件下穿刺犬髂后上嵴，成功抽取骨髓15～20 mL，置入肝素预处理的无菌试管内。PBS稀释后以1.077 Ficoll提取单个核细胞，调整细胞浓度2×107mL-1。PE标记抗犬CD34单克隆抗体（购自BD生物，批号：BD 550427）与CD34+磁珠结合，移入免疫磁珠分离系统（德国美天旋公司生产，型号：BD 557812），获取CD34+细胞，送流式细胞仪鉴定，4℃冰箱过夜手术备用。

1.3　人工血管预凝　取长3 cm、外径6 mm的ePTFE和涤纶人工血管各2条。于前肢抽取犬静脉血8 mL，分离血浆。每只人工血管加0.8 mL血浆与0.1 mL 2.5%氯化钙溶液，两端夹闭轻轻旋转混匀5 min预凝血管。开放一端，倾出混合液。实验犬用人工血管内再注入分离的0.5 mL CD34+细胞与对倍1 mL自体血浆、2.5%氯化钙的混合液，以2 r/min速度缓慢旋转20 min，倾出混合液。对照犬用人工血管不做此处理。所有人工血管均移至加有PBS的无菌培养皿中，置于冰上手术备用。

1.4　人工血管植入　犬戊巴比妥钠（30 mg/kg）腹腔麻醉，仰卧固定于手术台上。无贱条件下打开腹腔，解剖后腹膜，暴露并分离肾下腹主动脉段3～5 cm，近、远端置橡胶牵引带。肝素（0.6 mg/kg）静脉推注，无损伤血管钳阻断腹主动脉近、远端，中间离断，间置入ePTFE（或涤纶）血管，以5-0 prolene缝线两点法行端端吻合后开通血管，观察吻合口处有无漏血、腹主动脉搏动是否良好。分离同一水平段下腔静脉。同样方法间置入ePTFE（或涤纶）血管。术中静脉给予液体500 mL，青霉素80万U。术后每天青霉素80万U肌肉注射，连续3 d；阿司匹林300 mg随水饮，持续1周。每天观察犬手术肢体皮色、皮温、运动情况，股动脉搏动情况，后肢及腹壁静脉充盈情况。

1.5　人工血管检测　分别于术后第10和第30天处置两组实验犬和对照犬各1条。麻醉方法同前,显露移植的人工血管, 观察外形和通畅情况。切取人工血管及相连的部分自体血管管壁,迅速肝素化后纵向剪开，观察管腔有无狭窄、腔面是否光滑、有无血栓附着和新内膜覆盖情况。留取标本行HE染色、免疫组织化学及电镜检测。

2　结果

2.1　CD34+细胞的鉴定　锥虫蓝染色，流式细胞仪鉴定，由骨髓分离获得的CD34+细胞，活细胞数量为（2.6±0.3）×107 mL-1（图1）。

2.2　手术及术后情况　术中吻合口对合良好，无渗血，动脉可触及明显搏动，静脉充盈满意，术后2 h犬可正常站立。

2.3　组织标本的大体观　所有植入的人工血管均无明显的外压变形，与周围组织粘连较紧密。纵行剖开腔面，术后第10天取材的人工血管内部分腔面覆盖新内膜，且距吻合口越近新内膜越完整，流入道吻合口较流出道吻合口处完整，管腔内未见血栓附着，血管腔面光滑，吻合口无组织增生。实验犬与对照犬无明显差异。术后第30天实验组的人工血管内腔面完全覆盖新内膜,表面光滑,呈半透明状,未见血栓附着，管腔无狭窄（图2）。

2.4　光镜观察　光镜下可见第30天两组实验犬动脉人工血管的新生内膜组织细胞排列有序，其腔面为扁平的内皮细胞层，混有少量纤维素和血细胞混合物，内皮细胞层外为纤维母细胞、胶原和平滑肌细胞等。涤纶血管新生内膜贴附腔面紧密且完整，ePTFE血管新生内膜与血管腔面间有部分分离（图3）。

2.5　免疫组织化学检测　两组实验犬和对照犬的人工血管均行CD34抗原染色，第30天实验犬血管内膜见内皮细胞层呈棕黄色染色（图4）。

2.6　扫描电镜观察　第10天的实验犬人工血管电镜扫描可见：内皮细胞自吻合口向人工血管爬行，内皮细胞密度逐渐减少，其间见纤维蛋白和少量血细胞附着，部分区域可见散在分布呈梭形及正向梭形演变的内皮细胞。第30天ePTFE组实验犬人工血管电镜扫描示：吻合口处出现大量新生内皮细胞，沿血管轴向排列；细胞密度向人工血管中段逐渐减少,部分区域可见片状分布的内皮细胞（图5）。第30天两组对照犬人工血管内膜表面无内皮细胞覆盖，仅见血小板沉积形成的血栓及纤维组织排列。