大鼠肢体缺血再灌注早期血栓前状态的研究(一)
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作者：杨敏，马平，徐文会，张宏江
【摘要】 目的 探讨大鼠急性下肢缺血再灌注早期血栓的形成情况。方法 将大鼠随机分为假手术组、下肢缺血再灌注组两组。夹闭大鼠股动脉并用张力带绑扎下肢，建立急性下肢缺血再灌注大鼠模型。观察急性下肢缺血再灌注大鼠血小板膜糖蛋白GPⅡb/Ⅲa和血管内皮细胞血栓调节蛋白(thrombomoclulin，TM)的表达。结果 缺血再灌注组大鼠血小板膜糖蛋白GPⅡb/Ⅲa表达高于假手术组(P＜0.05)；缺血再灌注组大鼠血管内皮TM表达低于假手术组(P＜0.05)。结论 急性下肢缺血再灌注可能导致大鼠血栓前状态的形成。
【关键词】 肢体缺血再灌注；血栓前状态；血小板膜糖蛋白；血栓调节蛋白
Abstract：Objective To investigate the emerge condition of thromb in rats after ischemia?reperfusion of limb.Methods The rats were randomly divided into 2 groups：sham operation group(N group)；the hind limb ischemia reperfusion group (IR group).An animal model of acute hind limb ischemia?reperfusion was developed by clamping femoral artery and banding hind limb of rats.Changes in the expression of GPⅡb/Ⅲa of platelet membrane and TM of vascular endothelial cell in rats after ischemia?reperfusion of limb were observed.Results The expression of GPⅡb/Ⅲa of platelet membrane in the IR group was significantly higher than that of the N group (P＜0.05).The expression of TM of vascular endothelial cell in the IR group was significantly lower than that of the N group (P＜0.05).Conclusion Acute hind limb ischemia?reperfusion may induce the formation of prethrombotic state in rats.
Key words：limb ischemia?reperfusion；prethrombotic state；platelet membrane lycoprotein；thrombomodulin
缺血再灌注损伤是临床肢体血运重建后出现意外致残、致死的主要原因之一，是当今外科临床医生所常面对的具有挑战性的问题之一。创伤、断肢再植、术中使用止血带时间过长、腹主动脉瘤手术中钳夹血管及大血管栓塞再通等都可引起肢体缺血再灌注损伤。肢体缺血再灌注损伤是处于顿抑、休眠的肢体在血运重建之后的损伤导致的机体生理、生化改变和各器官的病理改变，这种损伤几乎影响到整个机体，进一步导致如心、肺、肾等远隔器官的损伤〔1～3〕，甚至发生多器官功能障碍〔4〕。尽管近来手术技术得以改善且围手术期管理水平有所提高，但死亡率和截肢率仍居高不下。如何认识再灌注损伤的预防和治疗，降低致残率和死亡率，将是我们长期所要研究的课题。
缺血再灌注损伤的机制是多因素和错综复杂的，其中微血栓的形成可能起到重要作用。研究证实再灌注时血管内皮细胞和白细胞激活，内皮细胞释放多种黏附分子，激活的内皮细胞与白细胞相互作用，对微血管和细胞损伤产生影响。150多年前，Virchow就指出血管壁的损伤、血液流动的变化、血液性质的改变是形成血栓的三要素，而血栓前状态是很多因素引起的止血、凝血和抗凝系统失调的一种病理过程，具有易导致血栓形成的多种血液学变化，是血栓形成的前期阶段。本试验通过黏附分子血小板膜糖蛋白GPⅡb/Ⅲa和血管内皮细胞血栓调节蛋白(thrombomoclulin，TM)的测定，从血管内皮损伤、血小板活化、抗凝作用减弱三个方面对肢体缺血再灌注后血栓前状态进行研究。
1 材料和方法
1.1 实验材料
1.1.1 实验动物 健康成年雄性SD大鼠，体重(200±30)g，购于山西医科大学实验动物中心。
1.1.2 主要试剂及仪器 山羊抗大鼠GPⅡb/Ⅲa抗体，SANTA CRUZ公司；抗大鼠TM抗体，LAB VISION公司；FITC标记兔抗山羊IgG，北京中山金桥公司；SABC免疫组化试剂盒，北京中山金桥公司；Olympus BX?51光学显微镜，日本；LeicaRM2015切片机，德国莱卡公司；IDA?2000数码显微图象分析系统，中科院北京空海科技公司；Calibur流式细胞仪，美国BD公司。
1.2 实验方法
1.2.1 实验分组 分为假手术组、缺血再灌注组两组，采用随机化原则，每组8只。
1.2.2 动物模型制作 术前常规禁食12 h，自由饮水。以20％乌拉坦(1 000 mg/kg)行腹腔内注射麻醉。将大鼠仰卧固定于操作台上，在后肢双侧股三角处剪毛，于腹股沟处沿血管走行纵行切开皮肤、皮下组织，钝性分离缝匠肌后部，游离股动脉、股静脉和股神经。在股动、静脉近端分别用动、静脉夹夹闭，并用张力带于股鞘下绑扎肢体阻断侧支循环。右颈部开口分离颈内静脉，置管建立静脉输液系统，接微电脑静脉微量输液泵。2 h后撤除血管夹，恢复动、静脉血流，3 h后进行标本采集。
1.2.3 实验动物的处理 假手术组与缺血再灌组相同的麻醉与手术操作，但未行血管夹闭及张力带绑扎；缺血再灌注组缺血2 h，再灌注3 h。
1.2.4 标本制备和检测方法 检测GPⅡb/Ⅲa需取血，从心脏采血0.5 mL(3.8％枸橼酸钠1∶9抗凝)，1 000 r/min离心5 min，取上清5 uL加入试管中；加入一抗5 uL，避光孵育20 min；加入荧光标记二抗5 uL，避光孵育20 min；加1％多聚甲醛200 uL固定30 min；PBS洗涤4 min，用流式细胞仪检测，每管收集GPⅡb/Ⅲa阳性细胞20 000个，记录GPⅡb/Ⅲa的阳性率。
检测TM需取血管，取股动脉、股静脉，脱水、石蜡包埋，用免疫组化方法定性检测血管内皮细胞上TM的表达。步骤如下：a)切片常规脱蜡至水，二甲苯(20 min)→二甲苯(20 min)→100％酒精(10 min)→100％酒精(10 min)→95％酒精(10 min)→85％酒精(10 min)→70％酒精(10 min)。b)3％H2O2室温孵育5～10 min，以消除内源性过氧化物酶的作用。蒸馏水冲洗2 min，冲洗3次。c)热修复抗原：将切片浸入0.001M枸橼酸缓冲液(pH 6.0)，微波炉加热至沸腾后断电，间隔8 min后，重复1次，冷却2 h，冷却后PBS液(pH 7.4)洗涤2 min，冲洗2次。d)滴加5％BSA封闭液，室温20 min。甩去多余液体，不洗。e)滴加稀释1∶50的一抗(抗大鼠IgG)，4℃过夜。PBS液冲洗2 min，冲洗3次。f)滴加生物素标记的羊抗小鼠IgG，室温20 min，PBS液冲洗2 min，冲洗3次。g)滴加试剂SABC室温20 min。PBS液冲洗5 min，冲洗4次。h)DAB显色，自来水冲洗。i)苏木素轻度复染、梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。再用BX51型Olympus显微镜及IDA?2000数码显微图像分析系统进行图像分析，每组观察30个高倍视野(×400)，随机取8个视野，以平均光度为指标进行半定量分析。
1.3 统计学分析 用SPSS 11.5统计软件，实验数据以(±s)表示，组间均数比较采用t检验。检验水准取α＝0.05，P＜0.05差异有显著性。
2 结 果
2.1 缺血再灌注组大鼠血小板膜糖蛋白GPⅡb/Ⅲa表达为(53.84±3.05)，高于假手术组(42.31±6.29)，二者比较具有统计学意义。
2.2 缺血再灌注组大鼠血管内皮TM表达低于假手术组(P＜0.05)(见表1)表1 急性肢体缺血再灌注大鼠血管内皮细胞TM的表达注：假手术组与缺血再灌组比较P＜0.05
3 讨 论
早在1944年，Jesse等〔5〕对止血带引发休克研究发现，止血带使用时间不超过3 h，引发止血带休克可能性极小，相反止血带使用时间超过3 h，则较易导致止血带休克，这种止血带休克不能通过静脉补充容量来预防。后来人们对动物骨骼肌缺血代谢变化进行研究发现，随着缺血开始，骨骼肌的无氧代谢开始，细胞内的三磷酸腺苷、磷酸肌酸进行性耗竭，缺血3 h三磷酸腺苷就完全水解，而在缺血后1 h磷酸肌酸就完全水解。在28℃下，如果止血带时间不超过3 h，随着再灌注开始，细胞内三磷酸腺苷在再灌注2 h后恢复正常水平，而磷酸肌酸则在再灌注后1 h恢复到正常水平。如果缺血超过3 h，而缺血的肢体温度保持在2℃，也不会导致细胞内三磷酸腺苷、磷酸肌酸的耗竭，从而避免了细胞损伤。这可能与低温下细胞能量代谢降低有关〔6〕。Raymond等〔7〕用无创性P标记核磁共振分光镜观察细胞缺血再灌注时代谢改变得出，在肢体长时间的缺血中，如果每缺血1 h插入10 min再灌注，则可维持细胞内三磷酸腺苷正常水平，快速恢复细胞代谢，保护细胞不受伤害；而Miller〔8〕等则认为插入5 min就可以恢复细胞正常代谢。临床手术中，使用止血带的最大时限为1.5 h，因此本实验选择室温下缺血2 h再灌注3 h造模以更加接近于临床研究。