RNA干扰抑制HepG2细胞AFP基因表达实验方法建立(一)

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作者：张国英 杨慧 刘明社 张芸 赵中夫

【关键词】 阳离子脂质体META;HepG2细胞;RNA干扰;AFP

摘 要 目的:筛选较理想的阳离子脂质体META/pGenesil-AFP质粒转染HepG2的方法。方法:将针对两条靶序列AFP1和AFP2的shRNA的DNA模板双链，连接于质粒表达载体，构建质粒载体pGenesil-1-AFP1（含绿色荧光蛋白GEP编码序列）及pGenesil-2-AFP2，用阳离子脂质体META/质粒载体pGenesil-1-AFP1转染HepG2细胞。荧光显微镜观察并计算不同剂量配比的脂质体/质粒载体混合液转染效果及微粒子化学发光免疫分析法检测不同剂量配比转染后对AFP基因表达的影响。结果:剂量比为8μL∶2.5μg条件，能有效地转染HepG2细胞，并有效抑制AFP表达且无细胞毒性作用。结论:本研究成功建立了阳离子脂质体META/质粒载体pGenesil-1-AFP1转染HepG2细胞实验方法。

关键词 阳离子脂质体META;HepG2细胞;RNA干扰;AFP

近年来发现的RNA干扰技术（RNAi）被认为是最有效基因敲除方法。实施siRNA对靶序列的抑制，成功地将双链RNA转染到细胞内是实验的关键。本研究将针对两条靶序列AFP1和AFP2的shRNA的DNA模板双链，连接于质粒表达载体，构建质粒载体pGenesil-1-AFP1（含绿色荧光蛋白编码序列）及pGenesil-2-AFP2，用阳离子脂质体META/质粒载体pGenesil-1-AFP1对HepG2细胞进行了转染实验研究，拟筛选较理想的阳离子脂质体META/pGenesil-1-AFP质粒转染HepG2的方法。

1 材料与方法

1.1 材料

高糖型DMEM培养基由美国GIBCO公司提供;胎牛血清由杭州四季青生物制品公司提供;L-谷氨酰胺由北京化学试剂公司提供;META-FECTENE转染试剂由德国BIONTEX提供;质粒载体pGenesil-1-AFP1、pGenesil-2-AFP2由武汉晶赛生物工程有限公司协助合成;AFP化学发光免疫分析试剂盒由美国BECKMEN提供;人肝癌细胞HepG2由北京大学感染科病毒研究室惠赠，本室传代。

1.2 方法

1.2.1 目标基因序列的选择及载体构建:以人肝癌细胞HepG2细胞AFP基因作为作用靶点（geneID:174），合成两条AFP-shRNA，分别为AFP-1，AFP-2，经BLAST软件查对及序列同源性分析，确定目标基因序列为:AFP-1:1275i-GCATTG-GCAAAGCGAAGCT-，AFP-2:694i-GCAGCU-UGUUAAAUCAACA-阴性对照（HK）:-GACTTCATAAGGCGCATGC-，构建质粒载体pGe-nesil-1-AFP1插入的DNA模板序列（包含GFP编码 序 列）:5＇- GATGCATTG-GCAAAGCGAAGCTTTCAAGACGAGCTTCGCTTT-GAATGCTTTTTTGTCGACA-3＇，3＇-GCGTAAC-CGTTTCGCTTCGAAAGTTCTGCTCGAAGCGAAAC GGTTACGAAAAAAC AGCTGTTCGA-5＇，构建质粒载体pGenesil-2-AFP2插入的DNA模板序列为: 5＇ - GATGGTCTTACA-TAAGAGGACTTTCAAGACGAGTTCTTATGT AA-GATTTTTTGTCGACA-3＇，3＇-GAGAATG-TATTCTTGAAAGTTCTGCTCAGGAGAATACATT CTGGAAAAAACAGCTGTTCGA-5＇，构建质粒载体pGenesil-2-HK插入的DNA模板序列为:5＇-GATGACTTCATAAGGCGCATGCTTCAAGACG-GCATGCGTTATGAAGTCTTTTTTGTCGACA-3＇，3＇-GCTGAAGTATTGCGTACGAAGTTCTG GTACGCGGAATACTTCAGAAAAAACAGCTGTTCGA-5＇，载体质粒的构建及酶切鉴定、DNA序列分析由武汉晶赛生物工程公司协助完成，浓度为2.5μg/μL。

1.2.2 待转染HepG2细胞的培养和准备:HepG2细胞生长于含10%胎牛血清的高糖型DMEM培养基中，并在37℃、5%CO 2 孵箱中进行培养。转染前选择对数生长期细胞，用0.25%胰酶-0.02%EDTA消化后吹打成单细胞悬液，以4×10 5 密度转种于放置了无菌盖玻片的6孔培养板中，每孔2mL。24h后观察细胞生长，铺满孔底面积约60%时用于转染。

1.2.3 转染试剂META/质粒载体混合液配制及转染:剂量配比在其建议范围（2∶1～7∶1）内选择设计，按META/pGenesil配比分六组，分别为空白对照组，3μL∶1μg组，6μL∶1μg组，8μL∶2.5μg组，12μL∶2.5μg组，15μL∶5μg组，每组设三个复孔。用pGenesil-1-EGFP-AFP1进行实验，以便荧光显微镜下观察转染效果。

取10支无菌1.5mL EP管，作好标记:取9μL，18μL，24μL，36μL，45μL脂质体分别加入A1，A2，B1，B2，C1管中;迅速加入无抗生素无血清的DMEM培养基，使得各管中总体积为300μL，轻轻混匀。a1，a2管中各加1.2μL pGenesil-1-EGFP-AFP1;b1，b2管中各加3μL;c1管中加6μL;然后各管中迅速加入无抗生素及血清的DMEM培养基，使得各管中总体积为300μL，混匀。将管A1、A2、B1、B2、C1中的脂质体对应加入a1、a2、b1、b2、c1管中，轻轻混匀。室温下静置20min。取出培养板将板中培养液弃去，用无血清及抗生素的DMEM培养基冲洗培养板两次后，留出三孔作为空白对照，每孔加1mL无血清及抗生素的DMEM培养基，其余各孔各加0.8mL。除空白对照外，每三孔加入相同剂量配比的META-pGene复合物各200μL，混匀。将培养板置于CO 2 孵箱中培养8h后，吸出孔中DMEM，每孔加入含10%胎牛血清的完全DMEM继续培养。培养24h后吸出细胞培养上清液，将盖玻片用PBS洗涤两次后置于荧光显微镜下观察，记录不同剂量配比的转染效果。

1.2.4 细胞培养上清液中AFP的检测:转染后24h，对各孔AFP进行检测。采用微粒子化学发光免疫分析法，美国BECKMEN公司试剂盒操作。